参考文章：
1.甲基化芯片入门学习-ChAMP包（二）
2.TCGA数据库的癌症甲基化芯片数据重分析
3.TCGA甲基化芯片数据质控和过滤
4.甲基化芯片数据的差异分析
5.甲基化芯片注释中的CpG shores, open sea 是什么
上一篇文章，写了如何下载以及整理我们需要的临床样品。得到了一个ChAMP对象，里面包含了甲基化信号beta值，以及样品的信息（肿瘤/正常）。上一篇里的过滤只是过滤了甲基化信号里的NA值，现在要用ChAMP包来进行进一步的过滤以及质量控制。这个包的官方使用说明PDF版：here
> library(ChAMP)
> library(dplyr)
> library(tibble)
> load('OSCC_29paired_methydata_ChAMPfiltered.Rdata')
（一）标准化前的QC
> QC = champ.QC(beta = myLoad$beta, pheno = myLoad$pd$sample_type)
[===========================]
[<<<<< ChAMP.QC START >>>>>>]
-----------------------------
champ.QC Results will be saved in ./CHAMP_QCimages/
[QC plots will be proceed with 412481 probes and 58 samples.]
<< Prepare Data Over. >>
<< plot mdsPlot Done. >>
<< Plot densityPlot Done. >>
< Dendrogram Plot Feature Selection Method >: No Selection, directly use all CpGs to calculate distance matrix.
<< Plot dendrogram Done. >>
[<<<<<< ChAMP.QC END >>>>>>>]
[===========================]
[You may want to process champ.norm() next.]
根据运行的提示，你会在当前文件夹里得到一个新文件夹，里面有3张QC的图。mdsPlot图 (Multidimensional Scaling Plot)主要看看不同分组样本是否分开；densityPlot图，每个样本的beta值的分布图，主要看看有无异常的样本；dendrogram，样本的聚类图。下面是我得到的3张图：
肿瘤和正常组织的分群
beta值看起来没有异常值
样品聚类图
（二）数据标准化（归一化）
#这里我设置的是4个核，跑了有一小会儿，不过电脑有些热。这一步比较费内存。
> myNorm <- champ.norm(beta=myLoad$beta,arraytype="450K",cores=4)
> dim(myNorm)
[1] 412481 58
#归一化后会产生很多NA,看一下哪些样品里含有NA
> num.na <- apply(myNorm,2,function(x)(sum(is.na(x))))
> table(num.na)
num.na
0 257463 259559 263148
55 1 1 1
#这里显示55个样品里都没有NA，有3个样品里产生了很多NA,接下来把这个样品和相对应的配对样品删掉
> library(stringr)
> names(num.na) = colnames(myNorm)
> dt = names(num.na[num.na>0])
> dn = str_replace(dt,"-01","-11")
> keep = setdiff(colnames(myNorm),c(dt,dn)) #只取colnames(myNorm)里的元素
> myNorm = myNorm[,keep]
> dim(myNorm)
[1] 412481 52
> pd = myLoad$pd
> pd <- pd[pd$sample_submitter_id %in% colnames(myNorm),]
> dim(pd)
[1] 52 4
（三）标准化后的QC
你可以使用ChAMP包的champ.QC功能再次验证一下是否需要去掉异常值（代码见上面）；你也可以根据参考文章2和3，进行常规的PCA和热图的检查，如下；
（1）主成分分析
> library(FactoMineR)
> library(factoextra)
> dat <- t(myNorm)
> group_list=pd$sample_type
> table(group_list)
group_list
Primary Tumor Solid Tissue Normal
26 26
> dat.pca <- PCA(dat, graph = FALSE)
> fviz_pca_ind(dat.pca,
geom.ind = "point",
col.ind = group_list,
addEllipses = TRUE,
legend.title = "Groups")
（2）热图
> cg=names(tail(sort(apply(myNorm,1,sd)),1000))
> library(pheatmap)
> ac=data.frame(group=group_list)
> rownames(ac)=colnames(myNorm)
> pheatmap(myNorm[cg,],show_colnames =F,show_rownames = F,
annotation_col=ac)
（3）相关关系矩阵热图
组内的样本的相似性应该是要高于组间的：
>pheatmap::pheatmap(cor(myNorm[cg,]),
annotation_col = ac,
show_rownames = F,
show_colnames = F)
根据上面的QC结果看，倒是没有什么离群值，所以不用去除样品了。
（四）去除异常值
上面的关系热图看出有两个样品不太好，要把它们去掉，以及它们对应的配对样品：
#去除异常值（5971，6953）
> pn = c("TCGA-CV-5971-01","TCGA-CV-6953-11")
> drop = str_sub(colnames(myNorm),1,12) %in% str_sub(pn,1,12)
> table(drop)
#drop
#FALSE TRUE
# 48 4
> myNorm = myNorm[,!drop]
> dim(myNorm)
#[1] 412481 48
> pd = pd[!(pd$case_submitter_id %in% str_sub(pn,1,12)),]
> save(pd,myNorm,file = "OSCC_26paired_after_ChAMP_norm.Rdata")
（五）差异分析
（1）甲基化位点差异分析
比较常见的差异甲基化分析是DMP（Differential Methylation Probe），用于找出差异的甲基化位点，ChAMP包里包含分析过程；然后根据你的分组信息，获得差异甲基化位点；最后用DMP.GUI查看下结果。并且分析得到的结果数据里自带了注释，可以拿去做富集分析。
参考文章：ChAMP 包分析甲基化数据
champ.DMP() 实现了 limma包中利用linear model计算差异甲基化位点的p-value。
> library(ChAMP)
> library(tibble)
> x <- pd$sample_type
#先把样品分类的名称改一下，中间有空格下面运行会报错
> x[which(x=="Primary Tumor")] <- "Tumor"
> x[which(x=="Solid Tissue Normal")] <- "Normal"
> pd$sample_type = x
> group_list <- pd$sample_type
#利用ChAMP找出差异甲基化位点
> myDMP <- champ.DMP(beta = myNorm,pheno=group_list)
> head(myDMP$Tumor_to_Normal) #差异甲基化位点结果，你会发现这个结果里基因名都给你标好了
logFC AveExpr t P.Value adj.P.Val B Tumor_AVG
cg12825070 0.6511792 0.3994829 33.31000 2.972469e-34 1.226087e-28 67.77294 0.7250725
cg09385093 0.6304708 0.3598621 30.87567 8.916709e-33 1.838987e-27 64.47550 0.6750975
cg14416371 0.6703583 0.3644433 29.56171 6.196156e-32 8.519323e-27 62.58603 0.6996225
cg15811515 0.6126625 0.4631829 28.27707 4.451309e-31 4.370805e-26 60.65743 0.7695142
cg18233405 0.4102125 0.2374704 28.06051 6.255518e-31 4.370805e-26 60.32398 0.4425767
cg07792478 0.6299208 0.4680037 28.05022 6.357828e-31 4.370805e-26 60.30808 0.7829642
Normal_AVG deltaBeta CHR MAPINFO Strand Type gene feature cgi
cg12825070 0.07389333 -0.6511792 5 148033708 F I HTR4 1stExon island
cg09385093 0.04462667 -0.6304708 2 119607885 F I IGR island
cg14416371 0.02926417 -0.6703583 11 43602847 R I MIR129-2 TSS200 island
cg15811515 0.15685167 -0.6126625 16 31580989 F I CSDAP1 TSS200 island
cg18233405 0.03236417 -0.4102125 8 98290148 F I TSPYL5 1stExon island
cg07792478 0.15304333 -0.6299208 8 65290484 F I MIR124-2 TSS1500 island
feat.cgi UCSC_CpG_Islands_Name DHS Enhancer
cg12825070 1stExon-island chr5:148033472-148034080 NA NA
cg09385093 IGR-island chr2:119607378-119607910 NA NA
cg14416371 TSS200-island chr11:43602545-43603215 NA TRUE
cg15811515 TSS200-island chr16:31580559-31581023 NA NA
cg18233405 1stExon-island chr8:98289604-98290404 TRUE NA
cg07792478 TSS1500-island chr8:65290108-65290946 NA NA
Phantom Probe_SNPs Probe_SNPs_10
cg12825070
cg09385093 rs71422594
cg14416371
cg15811515
cg18233405 high-CpG:98359303-98359424
cg07792478
> df_DMP <- myDMP$Tumor_to_Normal
#取基因名不为空白的行
> df_DMP=df_DMP[df_DMP$gene!="",]
> logFC_t <- 0.45
> P.Value_t <- 10^-15
> df_DMP$change <- ifelse(df_DMP$adj.P.Val < P.Value_t & abs(df_DMP$logFC) > logFC_t,
ifelse(df_DMP$logFC > logFC_t ,'UP','DOWN'),'NOT')
> table(df_DMP$change)
DOWN NOT UP
258 104980 619
> save(df_DMP,file = "OSCC_DF_methy.Rdata")
参考文章:甲基化芯片数据的差异分析
此处设置的logFC和p值的阈值是与原文一致的，由于甲基化的beta值不同于表达量，实际上用logFC也不是很对。推荐用deltabeta值替代logFC，就是甲基化信号值的差值。
火山图
> library(dplyr)
> library(ggplot2)
> dat = rownames_to_column(df_DMP)
> for_label <- dat%>% head(3)
> p <- ggplot(data = dat,
aes(x = logFC,
y = -log10(adj.P.Val))) +
geom_point(alpha=0.4, size=3.5,
aes(color=change)) +
ylab("-log10(Pvalue)")+
scale_color_manual(values=c("green", "grey","red"))+
geom_vline(xintercept=c(-logFC_t,logFC_t),lty=4,col="black",lwd=0.8) +
geom_hline(yintercept = -log10(P.Value_t),lty=4,col="black",lwd=0.8) +
theme_bw()
> p
热图
> cg <- rownames(df_DMP[df_DMP$change != "NOT",])
> plot_matrix <- myNorm[cg,]
> nnotation_col <- data.frame(Sample=pd$sample_type)
> rownames(annotation_col) <- colnames(plot_matrix)
> ann_colors = list(Sample = c(Normal="#4DAF4A", Tumor="#E41A1C"))
> library(pheatmap)
> pheatmap(plot_matrix,show_colnames = T,
annotation_col = annotation_col,
border_color=NA,
color = colorRampPalette(colors = c("white","navy"))(50),
annotation_colors = ann_colors,show_rownames = F)
除了上面的常规的火山图和热图，你还可以用ChAMP包里GUI来查看结果，里面也包含了可视化结果：
#你可以利用下面一行代码查看分析结果，也可以用head()来看
> DMP.GUI(DMP=myDMP[[1]],beta=myNorm,pheno=group_list)
比如热图：
或者探针位置的比列：
可以看到大部分的探针落在了CpG岛上。Shores 指的是位于CpG island上下游2kb 以内的区域；Shelves指的是位于shores 上下游2kb以内的区域；open sea指的是除了CpG islands, CpG shores, CpG shelves之外的其他区域。
看探针在基因组上的分布：
整个基因组分为Promoter, Body, 3UTR, Intergenic 4种区域，其中Promoter区又分为TSS200, TSS1500, 5UTR, ‘1stExon’ 4个区域。
（2）甲基化片段差异分析
DMRs(Differential Methylation Regions)主要指一连串的CpG都出现明显差异的区域。
#还可以利用ChAMP找出差异甲基化片段（DMR,Differential Methylation Regions),但目前只支持两组样品进行分析
> myDMR <- champ.DMR(beta=myNorm,pheno=group_list,method="Bumphunter")
> head(myDMR$BumphunterDMR)
seqnames start end width strand value area cluster indexStart
DMR_1 chr6 28602543 28603437 894 * 3.663917 128.2371 168092 78333
DMR_2 chr6 29520965 29521803 838 * 3.373399 121.4424 168249 78769
DMR_3 chr6 31695903 31698226 2323 * 1.841876 112.3544 169009 81605
DMR_4 chr13 78492568 78494171 1603 * 2.666064 111.9747 57435 28411
DMR_5 chr7 94284258 94285887 1629 * 2.138407 102.6435 184882 91745
DMR_6 chr11 14993378 14995770 2392 * 2.385313 102.5685 33948 16158
indexEnd L clusterL p.value fwer p.valueArea fwerArea
DMR_1 78367 35 35 0 0 0 0
DMR_2 78804 36 39 0 0 0 0
DMR_3 81665 61 61 0 0 0 0
DMR_4 28452 42 49 0 0 0 0
DMR_5 91792 48 90 0 0 0 0
DMR_6 16200 43 43 0 0 0 0
使用GUI查看结果：
> DMR.GUI(DMR=myDMR,beta=myNorm,pheno=group_list)
当然你选择不同的pvalue-cutoff会得到不一样的表格和图
（六）GSEA分析
有了差异甲基化位点/区域，就可以进行GSEA分析了。这里ChAMP包里也有自己的GSEA分析的功能。
参考文章：生信修炼手册：ChAMP分析甲基化芯片数据-GSEA篇
champ.GSEA默认对差异CpG位点和差异甲基化区域对应的基因做富集分析。
芯片中，我们直接得到的是差异的探针或者差异的区域，首先需要将探针或者区域映射到基因上，在映射的过程中，我们必须考虑到一个因素，基因和探针之间的关系。大部分的基因具有多个CpG位点，会对应多个探针ID。比如基因A上有50个差异CpG位点，基因B上具有2个CpG位点，很明显二者是有很大差别的，如果只考虑基因，那么A和B就是相同的，都是差异探针对应的基因。所以需要将基因对应的CpG位点考虑进来，gometh算法将基因覆盖的CpG位点个数作为基因的长度，用来矫正P值。
> myGSEA <- champ.GSEA(beta=myNorm,
DMP=myDMP[[1]],
DMR=myDMR,
CpGlist=NULL,
Genelist=NULL,
pheno=group_list,
method="fisher",
arraytype="450K",
Rplot=TRUE,
adjPval=0.01)
#查看结果
> str(myGSEA)
List of 2
$ DMP:'data.frame': 604 obs. of 9 variables:
..$ Gene_List（MSigDB数据库中定义的基因集合）: Factor w/ 8328 levels "3_5_CYCLIC_NUCLEOTIDE_PHOSPHODIESTERASE_ACTIVITY",..: 355 364 3728 822 361 3645 3547 8328 350 3733 ...
..$ nList （每个基因集包括的基因个数）: num [1:604] 1118 1038 590 2485 652 ...
..$ nRep （基因集合的基因与所有输入的gene list 中overlap的基因个数） : num [1:604] 1020 900 564 2266 586 ...
..$ fRep （overla的基因的比例） : num [1:604] 0.912 0.867 0.956 0.912 0.899 ...
..$ nOVLAP（位于该基因集合下的基因与输入的gene list 中overlap的个数）: int [1:604] 963 844 547 1973 561 942 719 1233 865 320 ...
..$ OR （费舍尔精确检验的odds ratio）: num [1:604] 5.32 4.7 9.92 2.16 6.92 ...
..$ P.value : num [1:604] 4.10e-54 9.41e-44 2.87e-42 1.36e-37 3.09e-37 ...
..$ adjPval : num [1:604] 3.41e-50 3.92e-40 7.97e-39 2.83e-34 5.15e-34 ...
..$ Genes （个数和nOVLAP相同）: Factor w/ 8309 levels "A1BG YWHAZ PPP1R13B INPP5D SOS1 CYTH3 YWHAE AKT1 RPS6KA2 AKT3 YWHAH SHC1 RPS6KB1 FOXO1 GSK3B AKT2 CD55 IGFBP1 G"| __truncated__,..: 4531 48 6038 4767 4543 5201 2142 2988 7084 3334 ...
$ DMR:'data.frame': 387 obs. of 9 variables:
..$ Gene_List: Factor w/ 8328 levels "3_5_CYCLIC_NUCLEOTIDE_PHOSPHODIESTERASE_ACTIVITY",..: 364 355 350 361 3728 3733 3642 2417 3721 3652 ...
..$ nList : num [1:387] 1038 1118 1062 652 590 ...
..$ nRep : num [1:387] 900 1020 956 586 564 327 258 364 98 335 ...
..$ fRep : num [1:387] 0.867 0.912 0.9 0.899 0.956 ...
..$ nOVLAP : int [1:387] 267 282 269 196 155 101 87 96 48 88 ...
..$ OR : num [1:387] 7.16 6.54 6.64 8.1 5.88 ...
..$ P.value : num [1:387] 6.45e-106 7.58e-104 1.08e-100 8.40e-87 3.60e-55 ...
..$ adjPval : num [1:387] 5.37e-102 3.16e-100 2.98e-97 1.75e-83 6.00e-52 ...
..$ Genes : Factor w/ 5211 levels "ABCB1","ABCB1 ABCB4",..: 18 1977 4419 4871 241 2451 3292 4981 4109 2908 ...
NOTE：对于fRep < 0.6 的基因集合，会过滤掉。官方是这样解释的 remove lists with less than 60% representation on array。
最后保存：
> save(myDMP,myDMR,myGSEA,file = "ChAMP_DMP_DMR_GSEA.Rdata")
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