本文内容：
- 载体构建基本原理
- 过表达载体构建
- 敲低载体构建
1.质粒构建
选定目的外源基因（DNA），先经过PCR扩增，随后用限制性内切酶分别切割载体和外源DNA片段，再使用DNA连接酶将切割后的载体与DNA片段连接，转入宿主细胞。最后经过筛选鉴定出正确的重组克隆质粒，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达
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1.1 双酶切
•定向插入
•防止自连
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1.2 载体元件
•启动子
•拷贝区
•标签
•真核筛选抗性
•原核筛选抗性
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2. 过表达质粒构建与验证
步骤：
- 1 找目的基因序列
2.2 引物设计与合成
2.3 PCR扩增目的条带
2.4 双酶切载体和目的条带
2.5 酶切回收
2.6 连接
2.7 转化
2.8 挑菌PCR鉴定
2.9 扩大培养，提取质粒
2.10 细胞转染
2.11 WB验证
2.1 找目的基因序列
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参考网站：
ensembl：http://asia.ensembl.org/index.html
NCBI：
2.2 引物设计和合成
目前实验室常用的过表达载体
pLVCV-19
pcDNA3.1
pCMV3
pET28a
pLHPGW
LPVW
pAAV
2.2.1 根据实验目的选择相应的载体
2.2.2 酶切位点选择原则
-
载体上存在且位于启动子后
-
目的片段上没有
引物设计工具
Snapgene
上游引物（F）：酶切位点+上游序列
下游引物（R）：下游序列+标签序列+终止密码子+酶切位点（反向互补前）
2.2.3 引物设计原则
一、引物一般长度在-15-30bp，过表达引物不超过60bp
二、引物需具有特异性-https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
三、引物GC含量在40%-60%之间
四、引物自身和引物之间不应该存在互补序列
2.3 PCR扩增目的条带
以PrimeSTAR Max Premix（2×）为例，以xxx gene 为例
2.3.1 体系
50ul体系
-
F(10um)：1ul
-
R(10um)：1ul
-
Template：<200ng
-
Mix：25ul
-
ddH2O：补齐到50ul
2.3.2 PCR反应条件：
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2.3.3 模板的选择
1、细胞系
2、组织
3、公司合成
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2.4 双酶切载体和目的条带
2.4.1 双酶切
选择NheI和XhoI对载体和目的条带分别进行双酶切
- 酶切体系
NheI：1ul
XhoI：1ul
10 x cutsmart buffer：3ul
载体/目的基因片段：1-2ug
ddH2O：补齐到30ul
- 酶切条件：37℃，30min-1h
2.5 酶切回收
首次做质粒构建，酶切后跑胶一定要加未切载体做对照
核酸胶：1%
电压条件：120v 30min
试剂盒：唯赞
提高酶切效率的要点
-
1、胶条充分融化
-
2、EB溶液预先加热
2.6 连接
- 连接体系
T4 ligase :1ul
T4 ligase buffer：1ul
酶切后的载体：
酶切后的片段：
ddH2O：补齐到10ul
连接条件：22℃ 1h
载体和片段的计算公式：
目的片段： 0.1pmol x 0.65 x kb=()ug
载体：0.03pmol x 0.65 x kb=()ug
举个例子：
A基因：1kb 65ng
B载体：8kb 156ng
那么计算后的连接比例（质量比）是 载体：目的基因 = 2.4：1
2.7 转化
1、感受态（DH5α）提前5min拿出来放冰上融化，切忌手握融
2、感受态细胞和连接产物10：1，通常是50ul感受态细胞+5ul连接产物
3、手指轻弹EP管混匀后，冰上静置30min
4、提前预热水浴锅，温度为42℃
5、热激90s
6、马上置于冰上2min
7、加500ul无抗性LB溶液，摇床37℃，200rpm,1h
8、5000rpm，离心5min
8、吸掉部分LB培基，留存约200ul涂板
2.8 挑菌PCR鉴定
第二天观察平皿长点情况，菌点均匀且分布恰当即为正常
1、准备2ml无菌EP管，加入含抗性LB溶液1ml
2、用小枪头挑取单个菌落到EP管内略微搅一下，弃掉枪头。一般挑取3-5个，不追求多
3、摇床37℃，200rpm，2-3h
4、菌落PCR鉴定，选择扩增目的条带的引物和PCR条件做鉴定
5、有阳性条带的样品送公司测序
测序引物
一般载体都有通用引物，写好载体名称发给公司即可，相对应的通用引物可网上查询
九、扩大培养，保菌，提取质粒
十、细胞转染
十一、WB验证
保菌：50%的甘油与菌液1：1混匀可在-80℃冰箱永久保存
细胞转染和WB验证：下次解说
3.Sh质粒构建与验证
-
3.1 靶序列的查找
-
3.2 引物设计与合成
-
3.3 载体双酶切
-
3.4 引物梯度退火
-
3.5 连接
-
3.6 转化，挑菌测序鉴定
3.1 靶序列的查找
https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/semi-configurators/shrna?activeLink=productSearch
3.2 引物设计与合成
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3.3 载体双酶切
AgeI：1ul
EcoRI：1ul
10 x cutsmart buffer：3ul
载体：1-2ug
ddH2O：补齐到30ul
3.4 引物梯度退火
F（100um）：1ul
R（100um）：1ul
T4 PNK：0.5ul
T4 ligase buffer：1ul
ddH2o：6.5ul
反应条件：37℃ 30min,95℃→25℃，每1min降低5℃
反应结束后引物稀释：5ul+995ul ddH2o，稀释后充分混匀
3.5 连接
连接体系：
T4 ligase :1ul
T4 ligase buffer：1ul
酶切后的载体：1ul
双链引物：5ul
ddH2o：补齐到10ul
连接条件：22℃ 1h
余步骤同前
参考链接多了，简书就给锁了，所以只能删除。
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