于是，TBtools - RNAseq 全家桶到位！
写在前面
很久很久以前，TBtools 解决了 RNAseq 数据分析中几个常见问题：
- 基因功能注释，NR，SWISSPROT，GO注释等
- 基因集功能富集分析，GO和KEGG
去年，通过插件众筹，我们完成了：
- 公开可获取测序数据 SRA 的信息整理
- Ascp Wrapper，高速下载测序原始数据
- SRAtoFastq 格式转换
- FastQC 测序质量评估
- Trimmomatics 测序数据清洗
- Kallisto Wrapper 读段计数与基因表达量估计
仔细观察其中，以前和去年做的事情，中间还差一个东西，那就是基因差异表达分析。
新插件 DESeq2 Wrapper
这几天，协助师弟们完成一些合作课题（....挺多合作的，希望他们得到锻炼的同时，也多少拿个共同作者吧...对我来说没啥用）。其中，让一个师弟尝试跑了下之前我写的差异表达分析流程，报错~~~。查了查，输入文件 ID 的大小写问题。伤心。很久很久以前，我就看差异表达分析这块很不爽。于是，Emmm... 一边等着听课，另一边我就优化了以前的 R 脚本，顺手几分钟就打了一个 TBtools R plugin。以后，这些什么差异表达分析，我就直接本地做了。能点点点，我还搞命令行干啥？
目前该插件已经上传到 TBtools Plugin Store（插件商店），所有用户选中该插件
Differential Gene Expression Analysis-DESeq2 Wrapper，点击 Install Selected Plugin即可完成插件安装。（注意：之前推文提到的 Rserver Plugin 需要先安装，不了解的具体翻历史推文）
界面介绍
大体给大家画一画，其实比较简单，就 三个输入文件。
首先是第一个输入文件Counts矩阵，几乎所有读段计数软件，比如HTseq，featureCounts，StringTie，Kallisto等，都可以输出并得到Counts矩阵，大体放到 Excel 长这样。
其次是一个样品归组信息，比如做了一个实验，对香蕉做了低温处理，那么会有 对到和低温两个分组的数据，分别有 3 个生物学重复，那么样品分组信息大体可以长下面这个样子。
注意是三列，尽管第二列看起来其实没啥用，但请还是保留。而第一行，注意到，必须是
#开头，或者直接删掉这一行。完全可以想象，如果你样品足够多，那么可以有 N 个 Condition，就一直列下去就可以了。一定要注释的是 Sample 名字，比如 sample1，sample2，。。。这些必须大小写都跟上述 Counts 矩阵的列名对应。
而最后则是一个比较信息，我们做基因差异表达分析，肯定是某个条件跟某个条件的两两比较，针对上述只有一个处理和一个对照，那么这个文件就很简单，如下
注意到，支持做 N 中比较组合，只要你的 conditions 数目够多。比如某个课题可能回事多个时间点，大体或许是：
# Sample1 Sample2
0days 3days
3days 5days
5days 7days
等等。
具体示例
我写这个插件的时候，随手找了一组数据，并打包成 Demo Data，随着插件分发。所以大伙应该任何一个人都能重复下述分析。把示例数据都放到 TBtools 之后，应该是这个样子。
第一次运行，这个插件会调用 TBtools 的 Rserver 插件，下载并安装
DESeq2，需要网络也需要一点时间；但此后每一次运行应该都很快。运行完成，对于每两个样品的基因差异表达分析，会输出三个文件，如下
分别是
- 一个MAplot，大体可以看看差异表达分析结果是否存在异常，绝大多数时候，看都不用看
- 所有经过差异表达显著性检验的基因的检验结果，未经过foldchange 和 pvalue或padjust筛选的表格，这个表格常用
- 自动筛选的，差异表达显著的基因，筛选标准为
|log2fc|>=1 and padjust<=0.05
具体值截取一部分给大伙看看
写在最后
Emmmm，看来 RNAseq 套装，要重见天日了。
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