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近几年表观遗传学已慢慢地走向了临床，ctDNA甲基化的研究，未来将成为早筛的利器，那么甲基化到底能做什么分析，怎么才能走向临床呢？有很多基础医学的老师想发一些关于癌症甲基化的文章，苦于没思路，所以就给各位老师安排上，这期分享2022年3月发表在 Brief Bioinform (IF:11.622)的一篇文章利用生信分析结合机器学习研究CpG岛甲基化表型病因和致癌转化的泛癌分析，该文章使用桓峰基因公众号里面的教程即可实现，有需要类似思路的老师可以联系我们！
摘 要
许多癌症类型显示出CpG岛的超甲基化，也被称为CpG岛甲基化表型(CIMP)，通常与生存变异有关。尽管对CIMP进行了广泛的研究，但这种可变性的病因仍不明确，可能是由于CIMP定义缺乏一致性。在本研究中，我们利用泛癌方法对CIMP进行了进一步的研究，聚焦于癌症基因组图谱(TCGA)中记录的26种癌症类型。我们系统地、不可知地定义了CIMP，排除了任何与年龄、性别或肿瘤纯度相关的影响。然后，我们根据最可变的DNA甲基化值对样本进行聚类，并分析得出的患者群体。我们的结果证实了CIMP在19种癌症中存在，包括胶质瘤和结直肠癌。我们进一步表明，CIMP与8种癌症类型的生存差异相关，在5种癌症类型中，CIMP代表了独立于临床因素的预后生物标志物。通过分析基因和转录组数据，我们进一步揭示了CIMP的潜在驱动因素，并将其划分为四类：直接参与DNA去甲基化的基因突变；组蛋白甲基转移酶突变；不参与甲基化转换的基因突变，如KRAS和BRAF，微卫星不稳定。在19例CIMP阳性癌症中，很少有共同的潜在驱动事件，这些驱动因素仅为IDH1和SETD2突变。最后，我们发现CIMP与肿瘤微环境特征如淋巴细胞浸润密切相关。总之，我们的结果表明CIMP不表现出泛癌表现，相反，CpG 岛DNA甲基化的普遍失调是由异质性机制引起的。
生信分析流程
这篇文章分析了泛癌中的甲基化表型，并探究了潜在的候选驱动事件以及与预后和免疫的联系，对于临床有不错的应用潜力，对于癌症甲基化方面的科研也十分有指导和参考价值。我们从文章中提取生信分析流程，看下文章中使用的数据集和生信分析方法，流程图上我们看到大概分为四个模块，因为是泛癌分析，所以方法上一定要有大数据分析的思维，整体把控，如下：
相关数据准备
数据集选择：组学
肿瘤样本数据集：TCGA数据库中的26个癌种ACC,BLCA,BRCA,CESC,COAD,ESCA,GBM,HNSC,KIRC,KIRP,LGG,LAML,LIHC,LUAD,LUSC,MESO,PAAD,PCPG,PRAD,READ,SARC,SKCM,,STAD,THCA,THYM,UCEC.
正常样本数据集：GSE77871 and GSE32149
基因集选择：
Methylation associatedgenes : BAZ2A, CTCFL, DMAP1, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, UHRF1, UHRF1BP1,UHRF1BP1L
Demethylation associatedgenes :
TET1, TET2, TET3, TDG,MBD1, MBD2, MBD4, CTCF, IDH1, IDH2
Histone methylationassociated genes :
H3K4 methylation:SETD1A, SETD1B, KMT2A, KMT2D, KMT2C, KMT2B, SMYD1, SMYD2, SETD7, SETD9, PRDM9
H3K9 methylation:SUV39H1, SUV39H2, EHMT2, EHMT1, SETD1B, PRDM1, PRDM2, MECOM, PRDM4, PRDM5,PRDM6, PRDM7, PRDM8, PRDM9, PRDM10, PRDM11, PRDM12, PRDM13, PRDM14, PRDM15,PRDM16
H3K27: EZH1, EZH2
H3K36: SETD2, NSD1,WHSC1, WHSC1L1, SMYD2, ASH1L, SETD3, SETMAR
H3K79: DOT1L
H4K20: SETD8, SUV420H1,SUV420H2
Histone demethylationassociated genes:
H3K4: KDM1A, KDM1B,KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D
H3K9: KDM3B, KDM3A,KDM4A, KDM4B, KDM4C, KDM4D, KDM4E, PHF8, JMJD1C
H3K27: KDM6A, UTY,KDM6B, JHDM1D, PHF8
H3K36: KDM2A, KDM2B,KDM4A, KDM4B, KDM4C, KDM4D
H4K20: PHF8, PHF2
生信分析方法
我们从文章的分析流程中提取所有的分析内容，整理出来就11个分析条目，构成了整个文章，本文属于纯生信分析的文章，首先分析甲基化对其进行clustger，之后对其进行机器学习，最后结合突变以及表达，构建预后模型确定独立影响因子，其实工作量还是很大的，发一篇这样文章估计耗时也得2年多时间吧，下面我们就看看哪些分析可以利用桓峰基因公众号的教程来实现，点击分析条码就会跳转到对应公众号的教程，跟着教程做，您也能发11+，如下：
6. 突变与基因表达之间发生变化的潜在病因
8. DNA甲基化组间OS生成分析（Kaplan-Meier）
11. 具有CIMP的肿瘤与特异性免疫亚型显著相关(CIBERSORT)
有老师问我AI算法这块怎么才能提高，我也是自学，并没有老师知道，基于R语言学习机器学习的，强烈推荐这本书，写得非常全面细致，代码清晰，点击下面的链接即可购买！！
研究结果
1. 基于甲基化的标准差(SD)分布，进行k-means聚类
基于探针beta值标准差(SD)的k-means聚类，在26种癌症类型(TCGA)中选择高度可变的探针。
过滤数据包括性别年龄，位点缺失，非CpGislands，性染色体以及非变量，如下：
2. 基于过滤后的CpG探针纯度校正DNA甲基化值的光谱聚类
基于过滤后的CpG探针纯度校正DNA甲基化值的光谱聚类结果的UMAP表示。根据所有显著差异甲基化探针的平均beta值对这些组进行索引。平均轮廓系数显示在每个癌症类型的右上方。所分析的26种癌症类型均表现出DNA甲基化失调;19例显示全球CGI超甲基化模式
3. CIMP在CpGislands、shores和shelves的平均甲基化概况
CIMP signature 1 (A)、CIMP signature2 (B)和非CIMP癌症(C)在CpGislands、shores和shelves上26种癌症类型的平均甲基化谱。分别将N_shelf、N_shore、CGI、S_shore和S_shelf 分成10个bin。
4. 随机森林分类器确定了10种癌症类型中CIMP的潜在基因组驱动因素
随机森林分类器的特征使用确定了10种癌症类型中CIMP的潜在基因组驱动因素(显示了随机森林优于随机分类器的10种癌症类型的排名)
CIMP阴性癌症类型的甲基化探针的平均beta值分布癌症类型是根据高甲基化组和低甲基化组之间的平均beta值的差异进行排名的。显著性用Kruskal Wallis检验计算。
6. 突变与基因表达之间发生变化的潜在病因
在DNA和组蛋白甲基化和去甲基化基因中，只有异柠檬酸脱氢酶IDH1/2和组蛋白甲基转移酶SETD2突变是CIMP的可复制驱动因子
CIMP与患者总生存期相关性的统计学检验，Cox回归进行多因素分析。
8. DNA甲基化组间OS生成分析（Kaplan-Meier）
Kaplan Meier表示DNA甲基化组间OS存在显著差异的8种癌症类型的单因素总生存期(OS)分析。(B) Kaplan Meier代表11种癌症类型，DNA甲基化组间OS无显著差异;95%置信区间(CI)用Kaplan Meier曲线周围的彩色区域表示。相关的log-rank检验p值显示为低甲基化组和高甲基化组(L-H)，当相关时，低甲基化组和中甲基化组(L-I)和中甲基化组和高甲基化组(I-H)。
Cox回归模型表示危害有显著关联。所有重要癌症类型的风险比(HR, 95% CI)与每个变量相关。高甲基化组风险比与低甲基化组相比。
随机森林分析中选择的基因作为低、中或高甲基化组及其相关通路的潜在驱动因子。
在高甲基化组中选择了相关探针中存在差异表达和高甲基化的基因，如下：
11. 具有CIMP的肿瘤与特异性免疫亚型显著相关(CIBERSORT)
CIMP评分与免疫标记和特征之间的Spearman相关系数。使用CIBERSORT预先计算的CIMP评分和细胞组成之间的Spearman相关系数。
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