食管鳞状细胞癌（oesophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是中国第三大常见恶性肿瘤。研究发现，肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME)中的免疫细胞与患者的预后有关。肿瘤浸润T细胞（tumor infiltrating lymphocyte, TIL）作为癌症免疫治疗的研究重点，为不同类型的癌症（包括ESCC）抗肿瘤免疫作出了重要贡献。然而，肿瘤浸润B细胞的作用却很少被探索。TME中的B细胞通常形成三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLSs），在肿瘤适应性免疫中起关键作用。然而，TLSs在ESCC患者中的预后价值和分子特征尚未明确。
为了深入研究TLSs在ESCC患者中的预后价值和分子特征，中山大学肿瘤防治中心文静课题组在《Clinical and Translational Medicine》（IF：8.554）杂志上发表题为“The prognostic value and molecular properties of tertiary lymphoid structures in oesophageal squamous cell carcinoma”的文章，文中作者采用的数字空间多组学分析技术（Digital Spatial Profiler，DSP）由非因生物提供！
TIPS:成熟的TLS是一个具有生发中心（GC）的次生淋巴样滤泡，分为两个区，以中心母细胞为主的暗区（DZ）和中心细胞、滤泡树突状细胞为主的亮区（LZ）；未成熟TLS为无GCs的淋巴细胞簇。
01研究目的
基于H&E染色玻片，研究者开发了一种深度学习（DL）TLS分类模型，以更精确和有效地评价TLS的存在和成熟状态；采用数字空间多组学分析技术（Digital Spatial Profiler，DSP）对ESCC中不同成熟状态下TLSs的细胞组成和分子特征及其对肿瘤细胞的潜在影响进行研究。
02实验设计
实验设计1：深度学习TLS分类器模型的建立与评价
实验设计2：不同TLS状态的ESCC中TLSs和肿瘤的细胞组成和分子特征研究
03研究结果及结论
1. ESCC中TLS成熟状态及预后价值评价
通过多重荧光免疫组织化学(mfIHC)，经过病理评价，A队列的394例 ESCC患者分为TLS-mature组（169例）、TLS-immature组（119例）、TLS-negative组（106例）（图1A-D）。生存分析结果显示，TLS-immature组的生存率显著高于TLS-immature组和TLS-negative组（P＜0.05），但TLS-immature组和TLS-negative组之间生存率无显著差异（P＜0.05）（图1E）。
图1 TLSs的成熟状态与ESCC患者的生存期相关
2. deep-learning（DL）TLS分类模型的建立与性能评价
共使用3852 个TLS+ tiles（来自A队列和TCGA数据库），其中训练集3082个，验证集577个，内部测试集193个。通过inception-resnet-v2 neural network用训练集和验证集数据建立DL TLS分类模型来识别TLSs并评估其成熟状态（实验设计1），总体准确性为95.3%。ROC曲线评估结果显示，该模型在患者水平TLS识别的总体准确性为100%（图2A）。基于内部测试集成熟TLS识别的AUC为0.973；相较于内部测试集，外部测试集AUC、准确性和灵敏度略有下降（图2 B）。同时利用该模型对B队列的256患者（639 玻片）进行TLS识别和成熟状态评价，分为TLS-mature（141例）、TLS-immature组（101例）、TLS-negative组（14例）。生存分析结果显示，TLS-mature的OS和DFS更高，TLS-immature和TLS-negative之间生存率无显著差异，该结果与A列结果一致（图2C）。
图2 DL TLS分类模型的建立与评价
3. ESCC中TLSs的免疫组成和空间转录组特征
为了深入研究不同成熟状态下TLSs的细胞组成和分子特征及其对肿瘤细胞的潜在影响。通过GeoMx DSP CTA技术（1833基因）对术前未经化疗或放疗的原位肿瘤（3个TLS-mature、3个TLS-immature、3个TLS-negative）进行空间转录组分析。选取75 个感兴趣区域（ROI），包括24个TLSs中的B细胞区（CD20）、24个TLSs中的T细胞区（CD3）、27个肿瘤区(pan-CK）（图3A）。聚类热图结果显示，各区所对应的marker基因均高表达，且TLSs B细胞区或T细胞区也观察到其他TLS markers的表达（图3B）。免疫细胞浸润分析结果显示，T细胞区和B细胞区均可检测到B细胞和T细胞（图3C）。相较于TLS-mature，TLS-immature中B细胞区中内皮细胞和B、T细胞区中成纤维细胞占比更高（图3D-E）。进一步对TLS-mature，TLS-immature之间B细胞区和T细胞区以及TLS-mature，TLS-immature、TLS-negative之间肿瘤区的趋化因子的表达差异进行分析，热图结果显示，不同成熟状态（TLS-mature、TLS-immature、TLS-negative）的TLS B细胞区、T细胞区、肿瘤区中一些趋化因子表达具有显著差异（图3F），可能是由于ROI中趋化因子分泌细胞的比例和活性不同所致。超多标单细胞空间蛋白质组有助于从单细胞分辨率了解参与趋化因子分泌的特定细胞类型
图3 TLS-mature，TLS-immature、TLS-negative ESCC中TLS和肿瘤区域的空间转录组特征
与TLS-immature相比，TLS-mature B细胞区增殖标志物 PCNA、MKI6、TOP2A的表达和增殖相关通路活性增高，GC启动的主控调控因子BCL6、IRF8和POU2AF119的表达水平增高，MHC I和MHC II的表达显著下降（图4A-B）；TLS-mature B细胞区中B细胞记忆性增加，揭示TLS-mature ESCC存在更长的体液免疫。TLS-immature B细胞区naive T细胞marker SELL表达量较高（图4C）。mfIHC显示，TLS-mature B细胞区Ki67+CD20+细胞占总CD20+细胞的比例(p < 0.001)和CD21表达强度(p <0.001)高于TLS-immature（图4D）。
图4 TLS-mature和TLS-immature TLSs中B细胞区的空间转录组学特征
与TLS-mature相比，TLS-immature T细胞区中MHC I、II分子和相关基因（B2M、TAP1、TAPBP等）表达增加（图5A）且抗原呈递通路表达上调（图 5B）。与TLS-immature相比，TLS-immature T细胞区中CD4+ Th细胞具有更高的Th17特征（图5C、D）。TLS-immature中浆细胞比例高于TLS-immature , B细胞比例低于TLS-immature（图5D）。TLS-immature和TLS-immature T细胞区间LAMP3+ DC特征无显著差异（图5C）；mfIHC结果显示，与TLS-immature相比，TLS-immature T细胞区CD4+ T细胞的百分比(p = 0.004)更高，而CD8+ T细胞(p = 0.168)和LAMP3+ DC占比(p = 0.092)更低（图5E）。
图5 TLS-mature和TLS-immature TLSs中T细胞区的空间转录组学特征
4. 成熟TLSs塑造了ESCC的瘤内免疫微环境
TLS-mature, TLS-immature 和TLS-negative ESCCs 肿瘤区域的基因表达比较结果显示，TLS-mature肿瘤区中G1/S细胞周期相关基因(CCND1、TP53、CDKN1B和E2F1)和趋化因子(CCL15和CCL20)的表达高于TLS-immature和TLS-negative；TLS-immature肿瘤区中MHC I和II分子的表达高于TLS-negative，两者均高于TLS-mature肿瘤区；TLS-negative ESCCs的肿瘤区中参与上皮-间充质转化(EMT)和肿瘤侵袭和迁移的基因表达高于TLS-mature和TLS-immature(图6A）。基因集富集分析(GSEA)显示，与TLS-immature或TLS-mature ESCCs相比，TLS-negative ESCCs肿瘤区中EMT通路显著富集(图6B)。73例TCGA ESCC患者bulk RNA数据分为两组TLS-mature ESCCs（11例）和mature TLS-absent ESCCs（62例）。GSEA结果显示mature TLS-absent 中EMT通路显著富集，而TLS-mature中同种异体移植排斥通路显著富集（图6C）。CIBERSORT结果显示，TCGA TLS-mature ESCCs组织中B记忆细胞和Tfh细胞的比例高于mature TLS-absent ESCCs（图6D）。TLS-mature ESCCs肿瘤内CD8+ T细胞浸润高于mature TLS-absent ESCCs（图6E）。97例ESCC患者生存分析显示CD8+ T细胞的高浸润或成熟TLSs的存在与患者预后的改善相关(图6F,G)，成熟TLS和高CD8+ T细胞浸润同时存在的患者预后最优，而缺乏成熟TLS和低CD8+ T细胞浸润的患者预后最差（图6H）。
图6 三种TLS成熟状态的ESCC中肿瘤区的空间转录组特征和瘤内免疫微环境
03文章总结
成熟的TLSs在ESCC中促进了免疫细胞的协作，并为B细胞的完全分化提供了特殊生态位，进一步诱导TLSs中CD4+ T细胞的激活和肿瘤区域CD8+ T细胞的有效募集，从而产生和维持有效的抗肿瘤体液和细胞免疫，改善ESCC预后。
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