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（小编在解读的时候发现本文的Figure2和Figure3完全放反了，不清楚是编辑失误还是作者的失误，小编在解读的时候已经更正顺序）
小编一直觉得单基因泛癌的文章进可攻（纯生信发文）退可守（补实验）。小编已经有不少客户发了单基因纯生信文章后，开始做实验进行深入研究，后续可以继续发文章写基金。比较老的客户已经成功拿到经费。
之前小编写过生信筛选的单基因如何补充实验
当时小编列举了一些实验，本文作者做了表达验证和功能实验，并没有做详细的机制。下图中打勾的都是本文做了的内容。
研究概述
N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）修饰是指RNA腺嘌呤上第6位N原子在甲基转移酶的作用下被催化形成的一种甲基化修饰。研究表明，m6A修饰的整体水平及其调控因子常在不同肿瘤中表达失衡，并在肿瘤的形成、增殖、侵袭和转移、放化疗抵抗、复发等过程中发挥重要作用。ALKBHB同源蛋白5（ALKBH5）是一种广泛报道的m6A RNA去甲基化酶，可以通过氧化去甲基化介导N-烷基化核碱基的修复。多项研究结果表明，ALKBH5可以根据不同癌症类型促进和抑制癌变，并且在肿瘤免疫微环境中发挥重要作用。
在这项研究中，作者利用生物信息学分析确定了ALKBH5在多种癌症中的生物学功能和预后价值。随后，进一步探索出ALKBH5表达与基因改变、甲基化状态和肿瘤免疫之间的关系，并构建了lncRNA-miRNA-ALKBH5网络。最后，使用基础实验证实了ALKBH5在胶质瘤细胞中的主要作用。
研究结果
一、ALKBH5在正常和肿瘤样本中的表达
下图A：利用GTEx、HPA和FANTOM5数据库分析ALKBH5在各种正常组织中的表达水平。结果显示，ALKBH5在正常人骨骼肌、心肌和舌组织中的表达水平较高。
下图B：利用TCGA数据库分析ALKBH5在33种不同肿瘤类型中的表达水平。结果显示，ALKBH5表达具有肿瘤特异性，并且在肉瘤（Sarcoma）中表达最高。
下图C：比较TCGA和GTEx数据库的不同肿瘤和相应正常组织中ALKBH5的差异表达。
二、ALKBH5的临床特征及预后价值
下图A：CGGA和TCGA数据库分析显示ALKBH5表达水平与胶质瘤分级呈正相关。
下图B-C：ALKBH5表达水平与WHO CNS5类型和胶质瘤亚型相关。
下图D：对收集的100例胶质瘤病例的分析表明，ALKBH5表达水平与胶质瘤分级呈正相关，这与在CGGA和TCGA数据库中得到的分析结果一致。
下图E：与ALKBH5低表达患者相比，ALKBH5高表达胶质瘤患者的OS较短。
下图F：GEPIA2数据库分析显示，ALKBH5高表达的BLCA、LAML、LGG和UVM患者的OS显著缩短，而CESC患者OS显著延长。
下图G：在BLCA、LAML、LGG和UVM中，ALKBH5高表达患者预后比ALKBH5低表达患者差。
三、ALKBH5的基因组关联分析
下图A：分析ALKBH5基因中不同类型的改变，包括突变、结构变异、扩增和深度缺失。结果显示，ALKBH5基因中最常见的遗传改变是肉瘤、子宫癌、肝细胞癌和胰腺癌的扩增；膀胱尿路上皮癌的突变；弥漫性大B细胞淋巴瘤的深度缺失。
下图B：ALKBH5基因突变率最高的前3位癌症是BLCA、BRCA-Her2和UCEC。
下图C：分析显示错义突变是ALKBH5基因突变的主要类型。
下图D-G：在TCGA神经胶质瘤数据集中分析ALKBH5表达与特定基因组特征（如体细胞突变和拷贝数变异(CNV)）之间的关系。
四、ALKBH5与免疫信号
下图A：利用STRING数据库绘制PPI网络，确定了10种ALKBH5结合蛋白，即FTO、METTL3、METTL14、ALKBH1、YTHDC1、YTHDF1、JMJD4、YTHDF2、DDX3X和WTAP。
下图B：前10个ALKBH5相关基因：GID4、TOP3A、MAPK7、NT5M、FLII、ZNF18、DRG2、COPS3、MED9和PRPSAP2。
下图C：40种癌症类型中ALKBH5与前9个ALKBH5相关基因之间的关联。
五、ALKBH5相关基因富集分析
下图A-C：对胶质瘤中的ALKBH5相关基因进行了GO-BP和KEGG富集分析。
下图D-E：GO-BP分析显示基因主要富集在WNT信号通路、先天免疫反应等。
下图F：在TCGA数据库中，GO-BP分析显示出相关基因对乏氧存在反应。
下图G：ALKBH5可以调节胶质瘤中免疫和代谢相关的信号通路。
下图H：GO-BP分析显示细胞周期过程、DNA代谢过程、DNA修复、DNA复制和细胞周期检查点的富集。
下图I：KEGG富集分析表明，相关基因富集在细胞周期、FoxO信号通路、DNA修复、p53信号通路、同源重组、Hedgehog等信号通路中。
六、ALKBH5与肿瘤免疫浸润
下图A：ALKBH5表达与LUAD、LUSC、UCEC、LIHC、CESC、SARC、BRCA和THCA的免疫和基质评分呈负相关，而与COAD、LGG和UVM中的免疫和基质评分呈正相关
下图B：研究ALKBH5在泛癌中与TIIC水平之间的关系。结果显示，ALKBH5表达与LUAD、LUSC、UCEC、CESC、SARC、BRCA和THCA中的多种免疫细胞呈负相关，与COAD、LGG和UVM中的免疫细胞呈正相关。
下图C：研究ALKBH5表达与MSI、TMB及新抗原之间的关系，以确定ALKBH5是否是多种癌症类型中免疫治疗反应的预测因子。结果显示，ALKBH5表达与LUAD、UCEC、CESC、COAD和READ中的MSI呈正相关，与PRAD、THCA、DLBC和KICH中的MSI呈负相关。
下图D：ALKBH5表达与TMB在UCEC、CESC、COAD、STAD、READ中呈正相关，而在KICH、LUAD和THCA中呈负相关。
下图E：ALKBH5表达与UCEC、COAD、READ和LGG中的新抗原呈正相关，与BRCA和THCA中的新抗原呈负相关。
下图F：分析泛癌中免疫检查点(ICP)阻断蛋白基因表达水平与ALKBH5的关系。结果显示，ALKBH5表达与UVM、KICH、LGG和COAD中的ICP基因呈正相关，这表明ALKBH5可以影响UVM、KICH、LGG和COAD对免疫检查点抑制剂治疗的敏感性。
下图：使用ImmuCellAI和xCell数据库进一步分析ALKBH5与胶质瘤中免疫浸润细胞之间的关系。结果显示，ALKBH5表达与胶质瘤中的各种TIIC呈正相关。此外，ALKBH5表达与胶质瘤中的免疫细胞和基质细胞的比例相关。
七、构建lncRNA-miRNA-ALKBH5调控网络
下图A：筛选miRWalk、miRDB、Targetscan和miRabel数据库，确定了49个可能靶向ALKBH5 mRNA的miRNA。
下图B：前10位ALKBH5 mRNA靶向miRNA是hsa-miR-4732-5p、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-362-3p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-589-5p、hsa-miR-4736、hsa-miR-6840-3p、hsa-miR-329-3p、hsa-miR-5008-5p和hsa-miR-6132。
下图C-D：在这10种ALKBH5 mRNA靶向miRNA中，5种miRNA（hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-362-3p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-589-5p和hsa-miR-329-3p)可在CGGA数据库中找到。
下图E：使用LncBase数据库确定了769个预测的lncRNA和73个经过验证的可能靶向hsa-miR-589-5p的lncRNA。前20个预测的lncRNA和前20个经过验证的lncRNA用于构建lncRNA-miRNA-ALKBH5调控网络。
八、实验验证
下图A：通过qRT-PCR分析各种神经胶质瘤细胞系中ALKBH5的表达水平。结果显示，与其他神经胶质瘤细胞系相比，U87-MG和U251-MG细胞系中的ALKBH5 mRNA水平显著高于其他神经胶质瘤细胞系，这与CCLE数据库分析结果一致。
下图B：使用特定ALKBH5靶向siRNA敲低U87-MG和U251-MG细胞中ALKBH5的表达。
下图C-G：CCK-8、划痕实验和Transwell试验结果表明，敲低ALKBH5抑制了U87-MG和U251-MG细胞的增殖、迁移和侵袭，而ALKBH5过表达则促进了LN229细胞的增殖、迁移和侵袭。
下图I-K：肿瘤异种移植实验表明敲低ALKBH5抑制了胶质瘤细胞的体内生长。
总结
N6-甲基腺苷修饰是信使RNA（mRNA）和非编码RNA（ncRNA）中最常见的化学修饰。ALKBH5是一种m6A去甲基化酶，与多种癌症类型发展有关。在这项研究中，作者探讨了ALKBH5在多种肿瘤，尤其是神经胶质瘤中的作用，包括ALKBH5在泛癌中的预后价值、遗传改变、功能分析及肿瘤免疫。研究结果表明，ALKBH5是一种潜在的免疫治疗生物标志物，可用于选择有希望受益于胶质瘤和其他癌症的免疫检查点阻断（ICB）治疗的肿瘤患者。
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