2023《Nature Genetics》 玉米抗旱优异种质材料

导读

在全球气候变化的背景下，干旱是影响作物生产的主要限制性因素之一。玉米这一主要作物极易受到水分缺失的影响，从而造成严重的产量损失。因此，鉴定和利用玉米抗旱种质资源对抗旱性状进行遗传改良具有重要意义。本研究报告了一个具有突出的抗旱基因型的热带/亚热带玉米种质CIMBL55的高质量基因组组装。基因组和遗传变异分析表明，在108个早前鉴定的抗旱候选基因中，CIMBL55中发现了的65个优异等位基因，推测这可能是构成CIMBL55优异抗旱性的遗传基础。值得注意的是，研究人员发现编码一种网状样蛋白的ZmRtn16通过促进液泡H⁺-ATP酶活性来提升抗旱性，这个发现提示了液泡质子泵在玉米抗旱性中的作用。

组装的CIMBL55基因组为植物抗旱性的遗传解析和改良提供了基础，也为全球粮食安全提供了支持。

论文ID

原名：Genome assembly and genetic dissection of a prominent drought-resistant maize germplasm
译名：玉米抗旱优异种质材料的基因组组装和遗传解析
期刊：Nature Genetics
IF：41.307
发表时间：2023年2月
通讯作者：秦峰
通讯作者单位：中国农业大学
DOI号：10.1038/s41588-023-01297-y

实验设计

结果

1. CIMBL55的基因组组装与注释

CIMBL55是来源于热带/亚热带(TST)的玉米种质资源，该种质资源被纳入全球种质资源库，用于复杂数量性状的遗传相关性研究。CIMBL55是该库中具有最显著抗旱表型的基因型。例如，70%的CIMBL55幼苗在干旱处理下存活，而B73和Mo17（两个基因组已被组装的玉米种质材料）幼苗在同样的处理下只有约20%存活（图1a）。CIMBL55植株的生长和发育均表现正常，与大多数优良玉米种质相似（图1b）。B73的叶片在田间缺水条件下开始出现卷叶和枯萎，而CIMBL55植株则表现正常和健康(图1c)。值得注意的是，在相同的田间干旱胁迫下，CIMBL55的产量损失(~40%)明显小于B73(~98%)和Mo17(~70%)(图1d)。

为探索影响CIMBL55抗旱性的遗传因素，研究人员结合了PacBio公司60×RSII和100×Sequel 2单分子实时测序技术、160×BioNano单分子光学图谱和35×Hi-C测序等技术，对CIMBL55基因组进行测序和从头组装。PacBio reads最初被组装成334个contig，N50为14.5 Mb。然后根据BioNano光学图谱对初始contigs进行纠错。去除96个冲突后，最终获得338个contigs，形成43个scaffolds，N50为107.0 Mb。然后，基于Hi-C数据，scaffolds挂载到10条染色体上。最终组装得到116个scaffolds，覆盖了约99.0%的基因组，最终组装的基因组大小为2159.5 Mb，scaffold N50为223.6 Mb(图1e)。BUSCO计算出基因组完整性为~98.0%。随机选取9个CIMBL55细菌人工染色体克隆进行测序，与从头组装的基因组比对一致，表示组装质量优异。

在B73和CIMBL55之间发现了大片段的重复和易位倒位事件。与B73和Mo17基因组的比较发现，在CIMBL55和SK12(另一种TST种质)基因组中，Chr7上有大约440 kb的缺失，Chr8上有大约560 kb的插入，表明这些差异可能在TST种质中普遍存在(图1f)。在4个种质中(CIMBL55、SK、B73和Mol17)，Chr9上的一个约2.2 Mb的倒位是CIMBL55特有的；然而，在NAM（nested association mapping）群体的25个亲本中，也有15个被鉴定出存在这种倒位，这表明它是玉米种质中常见的遗传变异(图1f)。

对CIMBL55基因组的注释显示，转座子元件占基因组的~83.95%。在CIMBL55中共注释了38439个高置信的基因，平均基因长度为4289 bp。circos图显示了横跨染色体臂的DNA-TEs和蛋白质编码基因具有相似分布模式，RNA-TEs的分布与着丝粒附近突出的高水平CG和CHG甲基化有关。

图1 | CIMBL55抗旱表型及基因组组装。
a, B73、CIMBL55和Mo17的幼苗存活率。在干旱处理前后，当差异最明显时对幼苗进行了拍照。比例尺，5cm。
b，1个月龄植物在温室中正常且水分充足条件下生长的具有代表性的形态。比例尺，10cm。
c, CIMBL55和B73两个月龄植株在田间缺水条件下生长状态。比例尺，20cm。
d，在水分充足和干旱条件下分别采集的B73、CIMBL55和Mo17的穗。比例尺，10cm。
e，用于CIMBL55基因组组装的流程。
f, CIMBL55中相对于B73、Mo17和SK基因组的大SV。每个图中的x轴表示所示区域的CIMBL55基因组序列。

2. CIMBL55与B73玉米基因组的基因共线性

基因共线性反映了不同基因组之间染色体上的基因及其排列方式。CIMBL55与B73基因组的共线性分析表明，73%的CIMBL55基因位于共线块中，27%的基因被认为是非共线基因(图2a)。

共线基因又分为三类。

• 第1类基因(42%)位于B73和CIMBL55的同源染色体上，该类型多数为单拷贝基因（一对一共线)。
• 第2类基因(29%)是位于各自基因组中两条不同同源染色体上的重复基因(多对多共线；图2a)。例如，15对第2类基因位于Chr8的共线块(B73, 171.42-172.37 Mb；CIMBL55, 173.94-174.66 Mb)和Chr3上的另一个共线块上(B73, 179.45-177.61 Mb;CIMBL55, 185.75-183.78 Mb)(图2b)。
• 第3类基因(2%)位于CIMBL55当前组装版本中不在染色体上的contigs中，但与B73中的对应基因处于共线块中。

非共线基因包括第4类(16%)和第5类(11%)基因。

• 第4类基因有直系同源基因，但不像在B73中的对应基因那样处于共线的位置。
• 第5基因(evalue＜10⁻²⁰)未鉴定出同源蛋白序列，但97%的基因在B73中存在同源DNA序列，说明这类基因可能发生了显著的基因结构变异或功能丧失。

所鉴定出的十个最大的共线块对应于十个玉米染色体。相对于第1类基因，第2类基因倾向于以更小的共线块(包含1,000个基因)存在(图2c)。根据从叶片样本中获得的RNA-seq数据，共线基因比非共线基因具有更高的转录丰度，这表明基因组重排可能损害了基因表达 (图2d)。玉米基因组经历了从远古祖先开始的全基因组复制事件（whole genome duplication event），有偏分离（biased fractionation）和二倍化事件。参照高粱基因组，研究人员构建了CIMBL55的亚基因组，发现其有偏分离现象与B73一致，这支持了玉米内部的进化保守性。研究人员发现CIMBL55的两个亚基因组中有61.5%的2类基因是成对保留基因，这表明第2类基因在玉米进化过程中相对保守。有趣的是，这些基因通过GO（Gene Ontology）富集分析富集到对各种刺激的应答中。为了深入了解这一点，研究者进一步研究了参与ABA信号通路和应激反应的几个基因家族的基因共线性，包括编码以下蛋白的基因：13个ABA受体(PYLs)、13个SnRK2s蛋白激酶、103个蛋白磷酸酶(pp2Cs)和55个脱水响应元件结合蛋白/C-repeat结合因子、130个NAM、ATAF和CUC (NACs)和128 bZIPs转录因子。其中72%属于第2类基因，明显高于全基因组水平上2类基因的占比（29%）。这些数据表明，在玉米进化过程中，参与环境响应和适应的基因倾向于重复保留。

图2 | CIMBL55和B73的基因共线性分析。
a，五类基因关于共线情况的百分比圈图。中间的圆圈表示CIMBL55中相对于B73的共线基因和非共线基因的百分比。中间的圆圈表示共线基因由第1、2、3类基因组成，非共线基因由第4、5类基因组成。其中小饼图表示的是根据B73中是否能识别出同源DNA序列，将第5类基因进一步分为两类。最外环表示共线基因中一对一共线还是多对一/多共线的比例。
b, B73和CIMBL55基因组间的共线图。上图为B73和CIMBL55的整个8号染色体。下图为B73 Chr8上的共线块:171.42-172.37 Mb和CIMBL55 Chr8: 173.94-174.66 Mb的放大视图，它们也与B73 Chr3上的共线块:179.45-177.61 Mb和CIMBL55 Chr3: 185.75-183.78 Mb共享同源性。同源基因以灰色线相连。
c，1-3类基因在不同大小的共线块中的比例。N，所述大小的共线块块的数目;n，共线块中共线基因的数目。
d, 1-5类基因在幼苗中的表达水平，不包括非表达基因。n，每个类型中表达基因的数量(FPMK >1)。对于箱状图，箱框横跨第一和第三个四分位数，中心线代表中位数，细线代表最小和最大的样本值。在所有的展示图中，五类基因以不同的颜色表示，如a所示。

3.基因变异有助于抗旱性

为了探究CIMBL55杰出抗旱性的遗传因素，研究人员在泛基因组水平上对遗传变异进行了研究，包含25个NAM亲本系和另外4个玉米品系SK12、Mo17、K0326Y、A188(组装的contig N50均大于5.0 Mb)。使用SyRi、Smartie-sv、CuteSV和Sniffles四个软件，对30个组装好的玉米基因组序列与B73_v5基因组进行比对，以确定最大数量的遗传变异。分析结果显示，总共非冗余地获得了17,581,014个结构变异(SVs)，包括16,311,409个插入/缺失(InDels)， 239,611个重复，496,685个倒位，499,973个易位和33,336个拷贝数变异 (图3a)。基于组装的基因组序列比对软件SyRi在识别各种类型的变异方面表现出有效性。而基于组装的contig序列比对的Smartie-sv和基于长度长比对的CuteSV在识别indel (>50 bp)方面比其他软件表现更好(图3a)。为了更深入地了解CIMBL55的基因组变异，研究人员还将B73和Mo17基因组比对回组装的CIMBL55基因组上，鉴定出遗传变异。结果显示，鉴定出841,911个DNA变异(>20 bp)。然后，在368个玉米种质组成关联组（做过干旱后幼苗存活率的耐旱性分析）中，共成功地对544,853个SVs进了行基因分型。此前，对该关联组的SNPs进行的全基因组关联分析(GWAS)和孟德尔随机化分析(Mendelian randomization analysis)分别预测到42个和97个基因为候选抗旱性基因。研究人员对CIMBL55基因组中这些位点的基因型进行了研究。根据之前的SNPs信息，CIMBL55含有了108个基因的基因型。CIMBL55中包含79个基因的优势等位基因，携带这些优势等位基因的种质在干旱后的存活率平均明显高于携带其等位基因的种质(图3b)。由于这些候选基因中的许多基因根据其基因表达的变化被预测为与抗旱性相关，研究者着眼于寻找与抗旱性密切相关的潜在sv，这些sv可能在影响基因表达方面发挥潜在作用。结果表示，有69个基因鉴定出存在与耐旱性相关的显著SVs，这些基因与前面存在SNPs的79个基因处于强烈的连锁不平衡中(LD, r²>0.5)(图3c)。值得注意的是，在CIMBL55中发现了65个基因的优势单倍型(SNP和SV均为抗旱等位基因)，这可能解释了CIMBL55在群体中的抗旱性优势。此外，在108个基因中，在CIMBL55以外的种质中发现了11个候选基因的优势单倍型(非CIMBL55等位基因)，表明其他种质可能含有与CIMBL55互补的遗传资源。(图3b)。研究人员发现，位于ZmABF4基因( Zm00001d031790，maizeGDB中B73_v4的基因 )第二内含子的SNP (S1474)和SV (S3205, 42 bp)与基因表达和植物抗旱性密切相关。ZmABF4编码一个bZIP转录因子，该转录因子是拟南芥ABA响应因子4的同源物，已被鉴定为ABA和干旱诱导基因表达的主要调节因子。携带ZmABF4^CIMBL55等位基因的种质与携带ZmABF4^B73等位基因的种质相比，具有更高水平的基因表达和抗旱性(图3d,e)。研究人员构建了过表达ZmABF4^B73编码序列的转基因玉米植株，来探究基因表达增加是否会带来抗旱表型。结果表明，与非转基因野生型(WT)植物相比，ZmABF4转基因株系在干旱暴露后存活率显著提高，并且在脱水处理中叶片失水率降低(图3f-h)。说明ZmABF4对玉米抗旱性具有正向调控作用，基因表达水平较高的 ZmABF4 ^CIMBL55可能是玉米抗旱性的有利等位基因。

图3|遗传变异的鉴定及其与抗旱性的关系。
a，用四种软件鉴定出的B73与其他30个优质玉米组合间的SNP、缺失(DEL)、插入(INS)、重复(DUP)、倒位(INV)、易位(TRA)和拷贝数变异(CNV)统计。
b，基于先前鉴定的SNPs, 108个候选抗旱基因中含有CIMBL55或非CIMBL55基因型的种质的平均抗旱存活率。这些基因座按照CIMBL55等位基因效应的降序排列。
c，具有显著SV的CIMBL55或非CIMBL55单倍型的种质的平均干旱存活率。本研究中分析的三个基因用红色表示，以前报道的三个基因用黑色表示。蓝色和黄色分别代表CIMBL55和非CIMBL55基因型。在b和c中，“Zm”代表玉米。在基因名称中被省略。
d，e，ZmABF4 S1479和S3205位点不同基因型种质的ZmABF4表达水平（d）和存活率(e)的小提琴图。对于小提琴图(在这张图和下面所有图中)，虚线代表第一和第三四分位数，中线代表中位数，须代表最小和最大的样本值。黄色和蓝色代表B73和CIMBL55基因型。'+'，加上插入; “−”，没有插入。括号中的数字表示双侧t检验中使用的样本量。
f，两个zmabf4过表达株系(ZmABF4-OE)的干旱生存试验。比例尺，5cm。
g，干旱下植物存活率百分比。每种基因型各试验18株，重复试验至少3次。数据代表平均值±s.d。
h, WT和ZmABF4-OE品系叶片失水率。每个基因型的4片叶子放在干净的实验台上脱水，称重90分钟。WT和OE 1重复实验3次(平均值±s.d)， OE 5重复实验2次(平均值)。通过双侧t检验:P <0.05， P<0.01(g，h*)，确定WT与所有OE植物之间有统计学意义。

4. 影响抗旱性的表观基因组变异

通过对B73、Mo17和本研究组装的高质量基因组序列CIMBL55三个种质进行全基因组亚硫酸氢盐测序(BS-seq)，能够准确评估和比较三个基因组的DNA甲基化状态。mCG和mCHG的总体水平在整个基因组中相当高，但在基因边界处明显降低。相比之下，包括RNA-TE区域在内的整个基因组中mCHH含量普遍较低，而DNA-TE元件中mCHH含量较高，表明这两种类型TE中CHH甲基化的调控机制不同。有趣的是，24-nt小RNA (sRNA)优先定位于基因边界和DNA- TE区域内，类似于mCHH的模式，表明这些区域可能涉及RNA介导的DNA CHH甲基化。基于组装的CIMBL55和B73基因组序列，研究人员也鉴定了sv相关基因组区域的DNA甲基化差异。在CIMBL55中鉴定出5346个插入片段，用于sv相关DNA甲基化分析。根据mCG、mCHG和mCHH的水平，将插入序列(包括其0.5 kb-侧翼区域)的DNA甲基化模式按层次聚类的方法分为5组(图4a-c和补充表10)。属于1-3组的插入序列显示出相当高水平的mCG、mCHG和mCHH，而属于5组的插入序列显示出普遍低水平的DNA甲基化(图4b)。值得注意的是，第4组插入序列的mCG、mCHG和mCHH水平明显高于侧翼序列(图4b,c)。DNA- TEs，尤其是DTH (DNA transposon terminal inverted repeat Harbinger)在第4组插入序列中富集(图4b)。插入长度集中在100 - 1000 bp范围内，且相对靠近邻近基因的转录起始位点，说明基因近端DNA-TEs（尤其是DTH），有甲基化CHH的倾向(图4b)。在ZmNAC075 (Zm00001d008817)的启动子区域发现了DNA甲基化差异，该基因编码含有NAC结构域的转录因子。该基因家族的几个成员已被报道在一些植物的耐旱中起积极作用。对CIMBL55和B73的基因组序列进行对可以发现，在ZmNAC075^B73的上游区域有两个插入变异，分别是S-9041 (182 bp)和S-1425 (5123 bp)，这导致了该基因比ZmNAC075^CIMBL55的CG、CHG和CHH具有更高甲基化水平。这两个插入与之前鉴定出的3'-UTR内的SNP之间存在着强烈的LD，这个SNP可能是一个用于基因表达的局部eQTL(图4d)。此外，携带ZmNAC075^B73等位基因的种质在干旱胁迫下的基因表达水平明显低于携带ZmNAC075^CIMBL55等位基因的种质(图4e,f)。为了阐明上述两种SVs的高甲基化对ZmNAC075^B73表达的影响，研究人员分析了两个DRD1基因的CRISPR靶向基因敲除(KO)系(zmdrd1-KO 1和zmdrd1-KO 2)，均是在LH244遗传背景下携带ZmNAC075^B73等位基因。据报道，拟南芥DRD1（defective in RNA-directed DNA methylation 1）可促进rna介导的DNA从头甲基化，从而在表观遗传学层面调节邻近基因的表达。全基因组BS-seq分析显示，与WT (LH244)相比，zmdrd1突变株中S-9041和S-1425的mCHH水平显著降低，而mCG和mCHG水平没有变化(图4g-k) ，但ZmNAC075^B73的表达显著增加(图4l)。这表明ZmNAC075^B73上游两个新发现的SVs的CHH高甲基化可能抑制了基因的表达。从而减弱了该基因在B73中对抗旱发挥的积极作用。

图4| SV 相关的DNA甲基化改变。
a，与SV相关的高或低DNA甲基化的统计。以B73和Mo17为参考在CIMBL55中鉴定的插入序列。短线表示映射到CIMBL55的亚硫酸氢盐测序(BS-seq)reads。橙色方框为CIMBL55中DNA高甲基化，蓝绿色方框为CIMBL55中两个插入区DNA低甲基化。
b，插入起始点及其0.5 kb-侧翼区域内mCG、mCHG和mCHH水平的热图。SV-length, CIMBL55中插入的长度。SV-TSS，插入位点到最近基因转录起始位点的距离。TE型，插入序列的特征为TE。MIX，多种DNA-TE和RNA-TE。
c, 5种类型插入片段0.5 kb侧翼区域DNA甲基化水平的分布。
d，基于ZmNAC075的水分充足条件下基因表达的关联作图。在这张图和下面所有的图中所提到的关联分析都基于一个混合线性模型。在所有变异的配对LD热图(P<10^-3)中，lead SNP(8_21515682)和两个插入位点的位置用线表示，其LD水平用红色星号表示。
e,f，不同等位基因种质在S-9014和S-1425位点ZmNAC075表达水平(e)和存活率(f)的小提琴图。括号中的数字表示双侧t检验中使用的样本量。
g, 上图为B73和CIMBL55中ZmNAC075位点的序列比对和DNA甲基化状态。浅蓝色框所示为ZmNAC075^B73上游的S-9014 (182 bp)和S-1425 (5123 bp)两个插入序列的高甲基化。下图为WT和两个zmdrd1-KO系中两个插入片段的DNA甲基化状态。
h-k, WT与两个zmdrd1-KO系之间S-9041和S-1425位点的DNA甲基化水平。显示了两个生物重复的平均值。l,ZmNAC075^B73在WT和两个zmdrd1-KO系中的相对表达量。统计学意义是通过四个生物学重复的双侧t检验确定的。

5. ZmRtn16在抗旱性方面具有积极作用

编码网状样蛋白的ZmRtn16 (Zm00001d047517)基因是在CIMBL55中鉴定出的65个优势等位基因之一。据报道，该蛋白家族的成员在种子萌发期糊粉细胞的内膜自噬和蛋白质从内质网(ER)运输到高尔基体的过程中发挥功能。ZmRtn16基因内部或附近的几个遗传变异与基因表达水平在不同条件下均存在显著相关性，表明该区域具有很强的基因表达调控现象(图5a-c)。研究人员发现，在3'-UTR中新鉴定出的插入S2290 (28 bp)与干旱胁迫后的植物存活率密切相关，并且它与位于内含子和最后一个外显子的其他非同义SNPs间存在强烈的LD(图5d)。携带ZmRtn16^CIMBL55等位基因(不含28 bp)的种质资源比携带ZmRtn16^B73等位基因(含28 bp)的种质资源具有更高的表达水平和更强的抗旱性，表明该变异可能影响基因表达和抗旱性(图5e,f)。为了确定这种变异是否真的影响了ZmRtn16 mRNA的丰度，研究人员从B73和CIMBL55中克隆了3’-UTR序列，其中包含一个先前确定的显著SNP (S2181)和28 bp的SV (S2290)。将两个片段分别融合到ZmRtn16^B73编码序列的下游，将构建的质粒转染到玉米叶片原生质体中。结果表明，包含从CIMBL55克隆的序列的样本比B73样本产生更丰富的ZmRtn16转录产物。此外，将S2181的核苷酸从B73基因型改变为CIMBL55基因型未能使ZmRtn16表达产生明显差异，而从B73序列中删除28 bp的SV则使转录产物丰度显著增加到与CIMBL55序列相似的水平(图5g)。这些数据表明，*****ZmRtn16******^B73*****3'-UTR的28 bp插入是调控*****ZmRtn16*****基因表达的变异，而不是SNP。研究人员对上述两种构建序列在玉米叶片原生质体中产生的ZmRtn16 mRNA的稳定性进行了研究。在加入转录起始抑制剂雷公藤甲素（Triptolide）的情况下，ZmRtn16^CIMBL55的mRNA衰减比ZmRtn16^B73慢，这表明ZmRtn16^CIMBL55 的3′-UTR可能比 ZmRtn16^B73更有利于维持mRNA的稳定性。有趣的是，在ZmRtn16^B73 3'-UTR的28 bp插入处注释出一个可能被两个玉米RNA结合蛋白识别的RNA motif(^G/_U ^U/_CGTGA)，这可能是导致上述差异现象的原因。

图5 | ZmRtn16 对玉米抗旱性有利。
a-c, GWAS的曼哈顿图，鉴定出了在充足水(WW)、中度干旱(WS1)和重度干旱(WS2)条件下与ZmRtn16表达水平相关的遗传位点。位于ZmRtn16及其侧翼10-kb区域内的snp用红点表示。
d，上图为基于ZmRtn16的干旱处理后存活率关联映射。显示了Chr9的132.5-134.0 Mb区域。下图为ZmRtn16基因区域的变焦视图和变异的成对LD热图。显著变异(P<0.05)通过线条连接到成对LD热图中。红色星号表示变异间具有强烈LD。
e, f, ZmRtn16在WS2条件下的表达水平和携带ZmRtn16在S2290有（+）或没有（-）28bp插入的不同等位基因的种质的存活率的小提琴图。黄色和蓝色分别代表携带ZmRtn16^B73和ZmRtn16^CIMBL55等位基因的种质。括号中的数字表示双侧t检验中的样本量。
g，左图表示ZmRtn16^B73和ZmRtn16^CIMBL55的下游序列的基因型的图。右图，ZmRtn16与不同3'-UTR序列融合时的mRNA丰度。不同的字母表示基于单因素方差分析（Tukey's检验）的显著差异（P < 0.05）。
h,i，抗旱性试验和叶片失水速率。
j. ZmRtn16-OE和WT在田间水分充足和干旱条件下的产量。对WT和两株ZmRtn16-OE植株的穗部进行了具有代表性的拍照。每种基因型的数据来自至少72株植物。h-j采用双侧t检验，差异有统计学意义。比例尺，5cm。

研究人员使用ZmUbi1组成型启动子构建了ZmRtn16过表达株系(OE, * ZmRtn16-OE)。结果发现，与野生型(WT)植物相比，过表达ZmRtn16* 的植物具有更强的抗旱性(图5h)。相比之下，在两个CRISPR靶向基因敲除株系(KO, ZmRtn16-crispr)中ZmRtn16功能的中断导致抗旱性受损(图5i)。值得注意的是，相对于WT植物，过表达ZmRtn16的植株叶片失水速率始终较慢，而KO株系叶片失水速率较快(图5h-i)。KO植株的气孔比WT更开放，OE植株的表型相反，这表明过表达ZmRtn16植株的抗逆性增强是由于气孔的大小。研究人员比较了ZmRtn16-OE、ZmRtn16-crispr和WT植物在充足水分和干旱条件下的生长发育。在水分充足的条件下，除了ZmRtn16-crispr植物的株高略短，三组植物之间没有观察到显著差异。然而，在干旱条件下，相对于WT植株，ZmRtn16-crispr植株表现出株高降低、开花期和吐丝期间隔延长(ASI，该间隔是干旱胁迫对玉米发育的重要表型)。相比之下，ZmRtn16-OE植株则表现出相反的表型。研究发现，在干旱条件下，ZmRtn16-OE植株的籽粒产量明显高于WT，但在水分充足的条件下，两者不相上下(图5j)。综上所述，这些数据表明ZmRtn16在植物抗旱性中发挥了积极作用。为了深入了解ZmRtn16的生物学功能，研究人员对ZmRtn16-gfp蛋白做了亚细胞定位分析，结果显示它与内质网组分共定位。免疫共沉淀(co-IP)纯化和质谱分析发现液泡H⁺-ATP酶亚基A (ZmVHA-A)和E3 (ZmVHA-E3)是与ZmRtn16相互作用的候选蛋白。分裂荧光素酶互补分析和co-IP分析都证实了它们与ZmRtn16-GFP的相互作用(图6a,b)。研究人员随后比较了ZmVHA-A和ZmVHA-E3在WT和ZmRtn16-crispr植物中的亚细胞定位。在ZmRtn16 -crispr植物中观察到ZmVHA-A和ZmVHA-E3的液泡定位存在明显缺陷，这表明ZmRtn16促进了ZmVHA-A和ZmVHA-E3的液泡定位(图6c)。此外，与WT植物相比，ZmRtn16 -crispr植物中液泡H⁺-ATP酶(V-H⁺-ATP酶)活性明显降低，而ZmRtn16-OE植物中V-H⁺-ATP酶活性增强。值得注意的是，液泡V-H⁺-焦磷酸酶(V-H⁺-PPase)的液泡定位和蛋白质活性在突变体中均未发生显著改变，这表明ZmRtn16并非V-H⁺-PPase生物学功能所必需的(图6c,d)。与WT植物相比，ZmRtn16-OE植物的液泡质子水平较高(pH值较低)，而ZmRtn16-KO植物的液泡质子水平较低(图6e)。随后，研究人员获得了CRISPR靶向的zmvha-E3-KO植物(可能是由于ZmVHA-E1存在功能冗余)。在zmvha-E3-KO植株上观察到类似的干旱敏感性表型，更进一步证实了由于液泡膜上ZmVHA-E3亚基的缺失导致V-H⁺-ATP酶缺陷从而降低了植物的抗旱性 (图6f,g)。综上所述，作者发现 ZmRtn16^CIMBL55 基因3'-UTR缺失28 bp，使得 ZmRtn16 的表达增加，利于ZmVHA-A和ZmVHA-E3在液泡膜中的定位，从而增强了V-H⁺-ATP酶活性，进而对抗旱性产生了积极影响。

图 6 | ZmRtn16与ZmVHA-A和E3相互作用，促进ZmVHA功能。
a，荧光素酶互补法检测烟叶细胞中ZmRtn16与ZmVHA-A和ZmVHA-E3的相互作用。比例尺，1cm。
b，利用玉米叶片原生质体对ZmRtn16、ZmVHA-A和ZmVHA-E3进行免疫共沉淀分析。
c, ZmVHA-A和ZmVHA-E1/E3在WT和KO植物液泡膜中丰度的免疫印迹分析。anti-Actin, anti-AVP1（拟南芥液泡H⁺-焦磷酸酶，V-H⁺-PPase)、anti-FBPA (果糖-双磷酸醛缩酶，一种细胞质蛋白)和anti-AHA (拟南芥质膜H⁺-ATPase)的免疫印迹表明，从叶片组织中提取的总蛋白数量相等，并成功分离到全膜组分、可溶性细胞质组分和液泡膜组分。b和c中显示的免疫印迹是来自至少两次独立重复的代表性结果。
d, V- H⁺-ATPase和V- H⁺ -PPase活性测定。
e，根的液泡pH定量。统计数据是从每种植物类型的6棵幼苗的至少9次测量中获得的。
F，植物抗旱性比较。在正常生长条件下和在干旱处理后分别拍摄。每种基因型各试验18株，重复试验至少3次。比例尺，5cm。
g,* zmvhv-E3-KO系相对于WT植株存活率的统计数据。数据代表平均值±s.d。统计学意义通过双侧t检验(d, e和g*)来确定。

讨论

研究人员从头组装了一个高质量的抗旱玉米基因型CIMBL55。在泛基因组水平上共鉴定出544,853个SVs，并在玉米关联组上进行了基因分型，用以与抗旱候选基因相关的SV鉴定和SV相关DNA甲基化分析。新鉴定出的与抗旱性显著相关的SVs可能并不是实际产生影响的变异位点，但它们可以作为进一步验证和等位基因挖掘的潜在目标。

液泡膜上有两种类型的H⁺泵，V-H⁺-ATPase和V-H⁺-PPase。V-H⁺-ATPase是一种蛋白质复合物，由13个亚基组成，这些亚基构成了peripheral-V1复合物 (包括A和E3亚基)和membrane-integral V0复合物。V-H⁺-ATPase水解一个ATP并将两个质子从细胞质转运到液泡。V-H⁺-PPase是一种同源二聚体，它利用无机焦磷酸盐(PPi)的能量来驱动一个质子在膜上的发生易位。这两种类型的质子泵利用不同的能量资源协同工作，确保植物即使受到环境压力时也能够保持适当的质子梯度用于液泡运输。研究人员之前报道过编码V-H⁺-PPase的ZmVPP1基因的遗传变异有助于玉米的抗旱性。而本研究通过SVs解析，发现ZmRtn16促进V-H⁺-ATP酶A和E3亚基的液泡定位，从而保证了V-H⁺-ATP酶的活性，并在抗旱胁迫中发挥积极作用。上述成果强调了液泡质子泵在玉米抗旱性中的作用。由于拟南芥双突vha-a2 vha-a3缺乏V-H⁺-ATPase V0复合体的两个亚基从而出现气孔关闭延迟，在V-H⁺-PPase突变体(vhp1)中也观察到类似的表型，所以液泡酸化是响应ABA后快速气孔关闭所必需的。VHA-C (V-H⁺-ATP酶V1复合物的C亚基)突变导致拟南芥出现极度的盐敏感性。OsVHA-A 的rna干扰水稻植株气孔扩大，耐盐性降低。通过选择3'-UTR变异或通过靶向基因编辑来增强ZmRtn16基因的表达，从而利用ZmRtn16的优势等位基因来提高抗旱性状是非常有潜力的。CIMBL55这一优势抗旱种质的高质量基因组组装为发现抗旱基因功能和抗旱遗传改良提供了重要遗传资源。

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