近日，凌恩生物客户中国农业科学院棉花研究所邢朝柱研究员团队发表在《The Crop Journal》的研究论文“The cotton mitochondrial chimeric gene orf610a causes male sterility by disturbing the dynamic balance of ATP synthesis and ROS burst”首次鉴定出哈克尼西棉胞质不育系（CMS-D2）携带的线粒体不育相关基因orf610a，并初步解析了不育系花粉败育的分子机制。
细胞质雄性不育（CMS）是一种主要由线粒体基因控制、并可被核恢复基因恢复的母系遗传性状，具体表现为植物不能产生正常可育雄配子，是作物杂种优势利用的重要途径之一，也是研究花药发育和核质互作的理想系统。CMS-D2不育系在不同环境条件下均表现出稳定的无花粉完全败育特征，在棉花“三系”杂种优势利用中具有广阔的应用前景。然而，关于棉花CMS-D2基因功能分析和花粉败育机制研究未见相关报道。
发表期刊：The Crop Journal（IF=4.407）
发表时间：2022
样本类型：棉花黄化幼苗的根
DOI: 10.1016/j.cj.2022.02.008
实验设计
1、研究对象
哈克尼西棉（G. harknessii）不育系（CMS-D2）ZBA。挑选干净、健康的成熟ZBA种子播种在发芽箱中，用水浸泡24 h，25℃避光保存7天。收集、清洗由此获得的约5克黄化幼苗的根。
2、研究方法
采用Illumina和Pacbio高通量测序方法，并进行RT-PCR、qRT-PCR、酵母异位表达、生化分析、拟南芥过表达和酵母双杂交（Y2H）分析，分析了导致花粉败育的候选基因的分子机制。
主要结果
1、ZBA中mt基因组的测序组装和结构特征
通过Illumina和PacBio测序，从头组装构建了ZBA mt基因组，长度为634,036 bp，GC含量为44.9%。
共鉴定出194个编码基因，24个tRNA和6个rRNA（表1），它们编码的蛋白质均超过100个氨基酸。
表1 mt基因组组装的特征
图1 细胞质雄性不育（CMS）系ZBAmt基因组圈图
使用5个参考数据库进行基因注释，其中NR和Swiss-Prot数据库的注释基因数量最多，而GO和KEGG的注释基因数量最少。5个参考数据库共同注释到的基因有11个。194个mt基因根据氨基酸的数量可分为6类。
图2 注释基因在5个参考数据库中的分布和氨基酸大小
2、ZBA中CMS基因的挖掘
在ZBA mt基因组中，鉴定出6个ORFs：orf186a-2、orf142a、orf116a、orf175a、orf280a和orf610a。
图3 三种类型的ORFs在mt基因组中的分布
在上述6个具有嵌合ORF特征的感兴趣基因中，未知序列位于orf186a-2、orf116a、orf175a和orf610a功能基因的3’末端，orf142a功能基因的5’和3’末端，orf280a中两个功能基因的5’末端。
图4 6个嵌合ORFs的基因结构示意图及半定量分析
3、4种不同材料的花蕾中6个嵌合ORFs的qRT-PCR分析
采用qRT-PCR方法对上述4个遗传材料（CMS-D2不育系ZBA、保持系ZB、恢复系ZBR和三系杂交种F1）中的6个嵌合的ORFs基因进行了相对基因表达分析，只有orf610a在不育系中高表达，而在保持系中难以明显表达。
图5 6个候选ORFs的表达模式
4、orf610a的表达抑制酵母的生长
在细胞生长和活力测试中，表达pYes2或pYesorf610a的转基因酵母在SC-ura扩增培养基平板上显示出相似的活力。相比之下，在orf610a表达诱导培养基板上，诱导pYesorf610a表达后，pYesorf610a转化子与pYes2转化子相比，细胞活力降低。在转基因酵母的液体培养中，也观察到了表达orf610a对酵母细胞生长的抑制作用。
图6 不同处理条件下，在（a）门和（b）纲水平上的不同围生生物膜的相对丰度的比较
5、ORF610a可引起ROS的积累，并抑制ATP的产生
作为细胞ROS指标的H2DCFDA的荧光强度显示在YPGal诱导10小时后，pYesorf610a转化的酵母细胞显著增加（图 7A）。与用pYesorf610a或pYes2转化但没有gal诱导的转基因酵母细胞相比，在gal诱导后，表达pYesorf610a的转基因酵母的ATP含量显著降低（图 7B）。
图7 酵母细胞中ROS和ATP的检测
6、在拟南芥中过表达orf610a的功能分析
通过转化拟南芥过表达orf610a基因，发现阳性株系花丝变短、花粉量变少，并且角果变短、结实率明显降低。
研究人员进一步通过分子生物学、生理生化和遗传学等多种分析手段，证实该基因编码蛋白ORF610a与细胞核编码蛋白在跨膜结构区域存在互作，过早启动细胞程序性死亡过程，从而导致花粉败育。
图8 融合线粒体靶向信号肽序列的orf610a过表达转化拟南芥及花粉育性鉴定
图9 ORF610a与RD22的相互作用及RD22基因的表达模式
图10 哈克尼西棉细胞质雄性不育系的花粉败育机制
总结
本研究通过棉花不育系（CMS-D2）线粒体基因组de novo组装以及基因组结果分析，鉴定到一个在不育系中特有的嵌合基因orf610a。该研究为深入揭示棉花细胞质雄性不育及其育性恢复分子机理奠定基础，对选育棉花优良恢复系和强优势胞质不育“三系”杂交种具有重要指导意义。
参考文献：
The cotton mitochondrial chimeric gene orf610a causes male sterility by disturbing the dynamic balance of ATP synthesis and ROS burst. 2022
DOI: 10.1016/j.cj.2022.02.008
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