上周为大家介绍了细胞死亡领域的全新概念PANoptosis，其中非常值得关注的一点是除了已经确定的两种上游分子ZBP1和RIPK1外，很有可能还有其他分子有待表征。今天为大家介绍nature最新研究揭示的其他分子：AIM2。
AIM2 forms a complex with pyrin and ZBP1 to drive PANoptosis and host defence
AIM2与pyrin和ZBP1形成复合物驱动PANoptosis和宿主防御
摘要
炎性小体是固有免疫反应的重要前哨，能够感应病原体并诱导受到感染的细胞。有几种炎性小体，分别检测和响应特定的病原体或者损伤相关的分子模式（例如PAMP或者DAMP）。在感染期间，活的病原体可以诱导多种PAMP和DAMP的释放，能够同时参与多个炎性小体传感器。，作者发现AIM2调控固有免疫反应传感器pyrin和ZBP1来驱动炎性信号通路，同时驱动PANoptosis炎性细胞死亡，在1型单纯疱疹病毒和Francisella novicida感染期间提供宿主防御。此外，作者观察到，AIM2，pyrin和ZBP1属于包含ASC，caspase-1，caspase-8，RIPK3，RIPK1和FADD的多蛋白复合物的一员，能够驱动程序性细胞死亡（PANoptosis）。总的来说，作者的发现定义了一种先前未知的AIM2，pyrin和ZBP1之间的调控和分子相互作用，能够驱动AIM2介导的多蛋白复合物的组装，称之为AIM2 PANoptosome，包括了多个炎性小体和细胞死亡调控因子。
结果
固有免疫反应中，炎性小体是至关重要的组分。在暴露于PAMP和DAMP后，炎性小体传感器形成一个多蛋白的复合物，激活caspase-1，导致下游基质的裂解，炎性信号通路和炎性细胞死亡。单个炎性小体能够对特异的PAMP和DAMP进行检测和反应，但是新的证据表明，由于存在多种PAMP和DAMP，多种炎性小体传感器可被激活以应对疾病，特别是活的病原体感染。
AIM2炎性小体已知能感知双链DNA(dsDNA)，并在发育、传染病、炎症性疾病和癌症中发挥重要作用。然而，AIM2在炎性小体形成和焦亡过程中的一些重要功能已经被观察到，但这些功能不能用我们目前对AIM2炎性小体的理解来解释。1型单纯疱疹病毒(HSV1)是一种dsDNA病毒，可导致终生无法治愈的复发性疾病，Francisella novicida是一种革兰氏阴性细菌，可在感染后迅速致死，是两种已知的激活AIM2炎性小体和细胞死亡的不同病原体。为了研究在这些病毒和细菌感染过程中暴露于大量PAMPs和DAMPs的细胞是否可以同时接触多个炎性小体传感器，作者用HSV1或新生F. novicida感染野生型骨髓源性巨噬细胞(BMDM)和几个主要炎性小体传感器单一缺失的BMDM。感染HSV1或者F. novicida能够诱导AIM2依赖和NLRP3依赖和NLRC4依赖得caspase-1裂解，释放炎性小体依赖的细胞因子白细胞介素IL-1β和IL-18以及细胞死亡。然而，在HSV1和F. novicida感染期间，Mefv–/– BMDM中的炎性小体和细胞死亡也存在部分减少的情况，暗示了这些感染激活了pyrin来驱动AIM2介导的炎性信号通路和细胞死亡。
因为观察到HSV1和F. novicida感染期间Mefv–/– BMDM中的剩余的AIM2介导的caspase裂解，作者筛选了集重固有免疫传感器以确定它们的参与。与野生型的BMDM相比，在感染HSV1和F. novicida后，在感染和无菌条件下，调控炎性细胞死亡的传感器ZBP1的缺失导致了caspase-1的裂解，IL-1β和IL-18以及细胞死亡的减少，而其他传感器或者适配器的缺失没有影响，这表明ZBP1也参与了HSV1和F. novicida诱导的炎性信号通路和细胞死亡。
为了确定pyrin和ZBP1是否以协同或者冗余作用降低caspase-1的激活和细胞死亡，作者接下来使用秋水仙碱抑制Zbp1–/– BMDM中pyrin的激活。作者发现，秋水仙碱处理的Zbp1–/– BMDM在HSV1和F. novicida感染期间能够抑制细胞死亡、caspase-1裂解、IL-1β和IL-18的释放：反映了在Aim2–/– BMDM中观察到的水平，表明了ZBP1和pyrin协同驱动AIM2依赖的反应。
作者还生成了Mefv–/– Zbp1–/–小鼠，发现与Mefv–/– Zbp1–/–BMDB相比，在HSV1和F. novicida感染期间，Mefv–/– Zbp1–/–BMDB的细胞死亡、caspase-1裂解、IL-1β和IL-18的释放减少。这些结果表明，在HSV1和F. novicida感染期间，pyrin和ZBP1协同诱导AIM2介导的炎性信号通路和细胞死亡。相似的，在HSV1感染期间，作者观察到人类THP-1巨噬细胞中细胞死亡和caspase-1的激活，这种激活受到了AIM2的短干扰RNA(siRNA)敲除或ZBP1和MEFV的联合敲除的抑制，表明AIM2介导、pyrin介导和ZBP1介导的细胞死亡同样发生在人类细胞中（HSV1的自然宿主）。此外，经人工合成的AIM2炎性小体配体poly处理的野生型和Mefv–/–, Zbp1–/–或者Mefv–/–Zbp1–/– BMDM之间的细胞死亡和caspase-1裂解相似，表明感染是导致pyrin和ZBP1协同促进AIM2介导的caspase-1激活、细胞因子释放和细胞死亡的唯一触发因子。
为了了解pyrin在HSV1和F. novicida感染期间是如何被激活的，作者首先评估了RhoA-GTP的活性，已知RhoA-GTP活性被抑制以激活pyrin以响应细菌毒素，例如Clostridium difficile toxin TcdB。作者发现，TcdB介导的RhoA-GTP活性抑制是以一种不依赖于AIM2和ZBP1的方式发生的，而HSV1介导的抑制依赖于AIM2而不依赖于ZBP1。作者接下来评估了RhoA-GTP在HSV1和F. novicida感染期间Aim2–/–, Asc–/– and Casp1–/– BMDM的水平。虽然RhoA-GTP在感染期间的野生型BMDM中缺乏，但是在Aim2–/–, Asc–/– and Casp1–/– BMDM中出现。相反的是，用合成的AIM2炎性小体配体poly处理没有抑制任何基因型的RhoA-GTP活性，表明感染具有整合AIM2介导的信号通路和RhoA信号通路级联来影响pyrin激活的显著能力。
接下来，作者研究了ZBP1在HSV1和F. novicida感染期间是如何被激活的。在甲流感病毒感染的情况下，ZBP1 Zα结构域检测核酸以驱动RIPK3-、caspase-8-和NLRP3介导的炎性细胞死亡。同样，作者发现，与野生型BMDM相比，Zbp1ΔZa2/ΔZa2 BMDM中HSV1-和F.novicida诱导的细胞死亡减少，并且与Zbp1–/–BMDM相似。
接下来，作者试图了解AIM2、pyrin和ZBP1在感染HSV1或者F. novicida期间的调控关系。AIM2的缺失完全消除了炎性细胞的死亡，而pyrin或者ZBP1的缺失导致部分减少，表明AIM2在pyrin和ZBP1的上有发挥作用。Aim2–/– BMDM中Pyrin和ZBP1的蛋白表达在HSV1或者F. novicida感染后显著降低。此外，它们在Asc–/–, Casp1–/–和酶失活的Casp1C284A/C284A BMDM以及经caspase-1抑制剂VX-765处理的野生型BMDM中的表达也降低，但是在Gsdmd–/–, Casp8DA/DA, Casp7–/–, Casp3–/– or Casp6–/– BMDM中没有观察到这个现象。此外，在在甲型流感病毒感染期间Aim2–/–, Asc–/–, Casp1–/–和Nlrp3–/–BMDM中，pyrin和ZBP1的表达没有受到影响。因此，AIM2介导的信号转导作为上游调节因子，在HSV1和F. novicida感染期间表达pyrin和ZBP1。
为了研究AIM2、ASC和caspase-1活性依赖信号如何促进受感染细胞中pyrin和ZBP1的表达的分子机制，作者评估了转录并观察到HSV1和F. novicida感染的Aim2–/–,Asc–/– and Casp1–/– BMDM与野生型相比，ZBP1和pyrin转录水平显著降低。先前的研究表明，干扰素信号能够诱导ZBP1和pyrin的表达。因此，作者研究了AIM2是否能够诱导IFN产生以驱动pyrin和ZBP1的表达。作者发现HSV1和F. novicida感染后，野生型BMDM产生了IFN-β，而Aim2–/–, Asc–/– and Casp1–/– BMDM却没有。此外，在AIM2-, ASC-和caspase-1缺陷细胞中补充IFN-β后，pyrin和ZBP1的表达恢复。这里观察到的IFN差异与先前的研究形成了对比，先前的研究并没有报道这些敲除物具有I型IFN的显著缺失。这些差异可能是由不同的时间点和MOI形成的。先前的研究表明，Asc–/–BMDM在感染后5小时轻微降低了IFN-β的释放，在感染后9小时降低了类似的IFN-β mRNA水平，Aim2–/–BMDM在感染后6小时显著增加IFN-β的释放，Asc–/–和Casp1/11–/–BMDM在感染后6小时显著增加IFN-β的释放。这些差异表明I型干扰素对F. novicida的反应可能是时间点和MOI依赖性的。
接下来，作者试图了解AIM2、pyrin和ZBP1在HSV1和F. novicida感染期间诱导炎性细胞死亡和PANoptosis。作者假设这些分子都是分子支架的一部分，能够同时参与细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡的关键蛋白。作者通过免疫共沉淀观察到了ASC与AIM2, pyrin, ZBP1, caspase-1, caspase-8, RIPK3, RIPK1 and FADD在HSV1和F. novicida感染期间的相互作用，而在Aim2–/–, Mefv–/–Zbp1–/–, Ripk3–/–Casp8–/– or Ripk3–/–Fadd–/– BMDM中没有观察到。相比之下，使用dA:dT处理可以使内源性ASC、AIM2和caspase-1发生相互作用，但pyrin、ZBP1、caspase-8、RIPK3、RIPK1或者FADD间没有相互作用，这表明感染具有形成AIM2多蛋白细胞死亡诱导复合物的独特能力。作者将这种复合物称为AIM2 PANoptosome。此外，作者还观察到在感染HSV1和F. novicid后12小时后，ASC与AIM2、pyrin和ZBP1在同一细胞中共定位。类似地，ASC也与caspase-8和RIPK3共定位。此外，这种复合物的形成是细胞死亡所必须的，因为它通过删除关键成分而被破坏，抑制了细胞对HSV1和F. novicida感染反应。
作者接下来将作者的发现扩展到体内模型，来自受感染的野生型小鼠的肺裂解物显示了关键细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡的分子激活以及pyrin和ZBP1的表达增加，但在Aim2–/–小鼠中未发现这种激活和表达增加。在Aim2–/–, Mefv–/–, Zbp1–/–和Mefv–/–Zbp1–/–BMDM和Aim2–/–小鼠的组织中，HSV1和F.novicida的斑块和菌落形成单位的数量分别增加。此外，所有缺乏AIM2的小鼠在8天内死于HSV1感染，缺乏pyrin或ZBP1的小鼠在13天内死亡，而大约70%的野生型小鼠存活下来。同样的，所有缺乏AIM2的小鼠在4天内死于新发性假丝酵母菌感染，缺乏pyrin或ZBP1的小鼠分别在9天或11天内死亡，而大约80%的野生型小鼠存活下来。这些结果强调了AIM2调节pyrin和ZBP1的表达、炎性细胞死亡和PANoptosis在宿主防御HSV1和F. novicida感染中的重要作用。
总结
总的来说，文章的发现确定了AIM2、pyrin和ZBP1之间的关键相互作用，在病原体感染期间驱动先天免疫反应。这种调控机制定义了活的病原体感染如何释放大量PAMP或者DAMP的分子基础，从而触发先天免疫和细胞死亡信号成分的协同激活，形成多蛋白复合物，并导致炎性细胞死亡和细胞因子的释放，从而形成免疫反应和宿主防御。
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