溃疡性结肠炎(UC)是炎症性肠病的主要形式。目前，UC的发病率全球范围内正在不断增加。虽然许多因素已被报道与UC相关，但对UC的病理认识仍然不足。肠嗜铬细胞(enterochromaffin, EC)作为肠内分泌系统的主要组成部分，在溃疡性结肠炎中起着关键作用，然而EC细胞的稀缺和分散分布严重限制了现有方法对其功能的研究。
为了深入研究EC细胞在UC中的确切作用，2022年4月山东大学高等医学研究院李石洋课题组联合山东大学齐鲁医院消化内科实验室，在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》（IF=6.617）杂志上发表题为“Digital Spatial Profiling Reveals Functional Shift of Enterochromaffin Cell in Patients With Ulcerative Colitis”的研究性论文（图1）。本文应用数字空间分析技术（DSP）从8例UC患者和7例健康对照者的结肠镜活检样本中获取转录组数据，对UC患者和健康个体的EC细胞进行转录组模式分析，阐明了人类结肠中EC细胞的转录特征，为EC细胞在健康和UC条件下的生物学行为提供了新的认识。
图1
研究亮点
研究团队仅应用DSP数字空间全转录组（WTA，Whole Transcriptome Atlas）技术，在2个TMAs芯片上选取15个ROI（8例UC患者和7例健康对照者），通过差异表达分析、基因集富集分析和加权基因共表达网络分析，识别差异表达基因、通路和共表达网络，清楚地表明EC细胞在UC中的独特表达模式，加深了对EC细胞行为的理解，同时为UC治疗提供了新的靶点。
非因生物的DSP数字空间全转录组WTA分析服务，可在细胞亚群水平上对组织进行18000+RNA即全转录组分析。目前可支持分析的物种有人和小鼠，可分析的样本类别有FFPE、FF、TMA、活检标本、穿刺样本等，支持WTA作为一个多功能的转录组研究工具，用于细胞图谱化和临床样本空间转录组学研究。
研究思路
研究结果
1. ES细胞的数字空间图谱转录组学分析
研究团队收集了78例结肠镜活检标本，采用DSP对含有55个合适活检标本的2个TMAs进行检测。选择EC细胞分布相对丰富的区域作为ROI进行后续测序（图2A）。QC后，选取15个ROI进一步分析。PCA分析显示了ROI组中独特的转录组模式（图2D）。
图2
2. EC细胞适应蛋白质合成和分泌
为了探讨EC细胞在健康组织中的功能，研究团队采用差异表达分析比较了EC- con组和Epi-Con组，发现与背景上皮相比，共10个基因在EC细胞中显著富集，而11个基因在背景上皮中富集（图3A, B）。同时研究团队利用GSEA在通路水平上研究EC细胞的功能。在GO生物过程类别中，以“ER蛋白靶向”、“核转录mRNA分解过程”和“翻译起始”为注释的基因显著富集，占基因表达和蛋白质合成的主要过程（图3C）。在GO分子功能类别中，富集基因被标注为“核糖体结构成分”、“mRNA结合”、“核小体结合”和“未折叠蛋白结合” (图3D)，而在GO细胞成分类别中，富集基因被标注为“核糖体”、“多体”、和“DNA包装复合物” (图3E)。KEGG通路分析也发现核糖体通路相关基因富集(图3F)。
图3
3. EC细胞共表达网络中Hub基因的鉴定
为了进一步阐明与EC细胞相关的转录组模式，研究团队使用WGCNA来识别这些细胞中的基因共表达网络。通过自动一步网络构建共检测149个共表达模块(图4A)。计算模块和样本参数(特别是ROI组和细胞类型)之间的关联(图4B)，发现Green3模块与EC细胞具有很强的相关性(相关系数= 0.73,P = 0.002)。此外，该模块中的基因与整个模块具有很强的相关性(图4C)，进一步说明了Green3在EC细胞中的重要作用。接下来，研究团队专注于Green3基因的功能，使用GO进行ORA（Over-Representation Analysis）分析（图4D），结果显示基因显著富集在“血清素代谢过程”、“胰岛素样因子I结合”和“初级氨基化合物代谢过程”。参与肽激素合成和分泌的通路也被丰富，这与EC细胞的神经内分泌作用一致。
图4
4. UC中EC细胞的特殊表达模式
为了确定EC细胞在UC条件下的行为。研究团队进行了差异表达分析，结果显示与EC-Con组相比，EC-UC组有49个基因显著上调，无下调(图5A)。大多数上调的基因，如REG1A、OLFM4和CD74，与炎症相关，在Epi-UC组中也上调(图5C, D)。同时研究团队对EC-Con/EC-UC、EC-UC/Epi-UC和ECCON/ Epi-Con三组进行DEG分析，并生成了包含三组DEG的热图 (图5C)，以及详细描述三组DEG之间重叠的UpSet图(图5D)，结果显示6个基因(TPH1、CHGA、CHGB、RGS2、DDC和PCSK1N)在UC和健康条件下均在EC细胞中富集，其中CHGB在UC中显著上调。
图5
5. UC中EC细胞功能从化学感觉到分泌和抗原呈递的转变
为了确定UC条件下EC细胞的功能变化，研究团队使用GO术语和KEGG通路进行了GSEA分析，发现UC患者EC细胞中富集了与蛋白合成相关的GO注释基因，如靶向膜的共翻译蛋白、翻译起始和核转录mRNA分解过程(图6A, C)，表明UC蛋白合成上调。KEGG通路分析显示与炎症性肠病以外的自身免疫性疾病相关的通路富集，如系统性红斑狼疮、异体移植排斥反应和I型糖尿病(图6D)；这表明UC和其他自身免疫性疾病之间存在内在联系。GO项分析和KEGG通路分析均显示，与化学和嗅觉相关的通路下调最为显著（图6A, B, D, F）。
图6
6. scRNA-seq和免疫荧光染色验证数据
为了验证上述研究结果，研究团队使用了一个包含18例UC患者和12例健康对照者结肠细胞单细胞转录组数据的数据集。通过scRNA-seq在EC细胞中富集的基因和DSP在EC细胞中富集的基因比较，以及WGCNA在EC细胞相关的共表达模块中富集的基因之间的重叠（图7C），发现了特异性富集于EC细胞的9个基因(RGS2、PCSK1N、CHGB、CHGA、TPH1、CRYBA2、SCG5、IGFBP3和DDC)。免疫荧光染色进一步验证了RGS2和CHGB在EC细胞中的表达(图7D)。
图7
文章总结
在本研究中，研究团队使用DSP分析了UC患者和健康个体EC细胞的转录组模式。结果表明，EC细胞比上皮细胞中的其他细胞簇具有更大的蛋白质合成和激素分泌能力。EC细胞经历了从感觉到分泌和抗原提呈的功能转变，同时CHGB上调。因此，本研究提供了对EC细胞行为的更深入的理解，并为UC治疗提供了新的靶点。
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