史晏榕, 孙宇辉
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摘要: DNA克隆和组装技术是重要的分子生物学工具。近年来，随着合成生物学的飞速发展，对大片段DNA元件的快速有效组装就显得尤为关键。同时，各种DNA克隆和组装技术也竞相发展起来。通过对基于非典型酶切连接、PCR、同源重组、单链退火拼接等原理发展起来的各种DNA克隆和组装技术进行综述，为合成生物学的进一步发展提供有效的操作工具。
关键词: DNA克隆和组装 非典型酶切连接 PCR 同源重组 单链退火拼接
Progress in DNA cloning and assembly techniques
SHI Yan-Rong, SUN Yu-Hui
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Abstract: DNA cloning and assembly techniques are essential tools for molecular biology research. With the recent advances in synthetic biology, efficient and fast assembly of large DNA including a number of genes is becoming more and more important. Meanwhile, a variety of DNA assembly methods are also developed very quickly. In this paper, various DNA assembly methods based on atypical enzyme digestion and ligation, PCR, homologous recombination, single strand annealing and splicing are summarized for providing effective technique tools for the further development of synthetic biology.
Key words: DNA cloning and assembly Atypical enzyme digestion and ligation PCR Homologous recombination Single strand annealing and splicing
DNA克隆和组装技术是现代分子生物学的一项重要工具。近年来，随着结构组学和蛋白组学的发展，特别是旨在应用工程学的研究思路及手段去设计改造基因、生物元件、生物途径，甚至整个基因组的合成生物学的迅速发展，组装DNA元件就显的越来越重要。虽然传统的利用II型限制性内切酶产生合适的DNA片段的酶切连接克隆策略仍然在发挥着重要作用，但是由于酶切位点有限，这种方法在平行无缝克隆或多DNA片段组装方面已显现出其不足之处[1]。本文综述了近年来根据非典型酶切连接、PCR、同源重组、单链退火拼接等原理发展起来的各种DNA克隆和组装技术，为合成生物学更加快速而高效地进行大片段DNA的克隆和组装提供技术支持。
1 非典型酶切连接技术
传统的利用II型限制性内切酶的酶切连接克隆策略虽然仍然在分子生物学领域发挥着重要作用，但是由于可用的酶切位点有限，其越来越难以满足研究者通过多片段组装来获得大片段DNA的需要。因此，迫切需要一些不受酶切位点限制的技术来解决这一问题。例如，依赖于同尾酶的BioBrickTM技术和依赖于IIs型限制性内切酶的金门分子克隆技术(Golden gate cloning)技术。
1.1 依赖于同尾酶的BioBrickTM技术
同尾酶(如Xba I和Spe I、Bgl II和BamH I等)是指一类能够识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能产生相同黏性末端的限制性内切酶。当酶切后的两个片段相连时，原来的酶切位点将不复存在，也就不能再被原有的限制性内切酶所识别，达到“焊死”状态。
BioBrickTM技术最初由美国麻省理工学院的Knight研究组于2003年提出，它是通过在目的生物元件两端设计前置序列和后置序列(即同尾酶)，然后利用这些同尾酶将这些不同的生物元件组合在一起产生新的有功能的元件[2](图 1)。因此，BioBrickTM技术最大的优势就是能够利用一对同尾酶实现多个DNA片段的组装。当然，该法仍不能避免对DNA序列本身的依赖性，而且最主要的缺点是在元件连接处会留有额外新增的8 bp的“疤痕”，而这段“疤痕”在某些情况下是不可接受的[3]。
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| 图 1 BioBrickTM技术组装流程Figure 1 BioBrickTM assembly |
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利用BioBrickTM技术可以将一系列独立的生物元件，包括启动子、核糖体结合位点(RBS)、开放阅读框(ORF)及终止子等按照一定的顺序组装成一个有功能的基因或生物途径[4]。在2013年，韩国玄武大学的Sohng研究组就成功利用BioBrickTM技术将来自于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)参与2-脱氧链霉胺(2-deoxystreptamine，2-DOS)生物合成的3个基因btrC (DOI合成酶基因)、btrS (氨基转移酶基因)和btrN (脱氢酶基因)以及其相应的T7启动子、lacO操纵子、RBS序列及T7终止子进行体外组装，并在大肠杆菌中成功实现了异源表达[5]。本研究组在庆大霉素(Gentamicin)等氨基糖苷类抗生素生物合成机制研究过程中[6]，通过BioBrickTM技术对参与庆大霉素前体生物合成所需基因genC (DOI合成酶基因)、genS1 (氨基转移酶基因)、genE (脱氢酶基因)、genM1 (糖基转移酶基因)进行了定向拼接，并成功检测到目标产物2-N-acetylparomamine。
1.2 依赖于IIs型限制性内切酶的Goldengate cloning技术
IIs型限制性内切酶(如Bsa I、Bbs I、BsmB I和Sap I等)是一类特殊的限制性内切酶，与分子生物学最常用的II型限制性内切酶(识别位点为回文对称序列，切割位点与识别序列重叠)不同，其识别位点是一个非回文对称的序列，而切割位点位于识别位点的外侧。因此，当被IIs型限制性内切酶酶切后的两个片段相连时，原来的识别位点将不复存在，在后续的酶切连接反应中也就不会再次被切割，也达到“焊死”的效果。
Golden gate cloning (图 2)就是利用IIs型限制性内切酶的这一特性在这些酶的识别序列外侧人为地设计切割位点不同的序列，然后利用同一限制性内切酶产生不同的黏性末端，从而一次性组装多个片段[7]，克服了传统多片段组装中需要同时使用多个不同限制性内切酶的不足。相对于BioBrickTM技术而言，该技术的最大特点是不会引入任何额外的“疤痕”，从而实现了DNA片段的无痕连接，但缺点是仍然避免不了内切酶本质上对DNA识别序列的依赖性。
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| 图 2 Golden gate cloning技术组装流程Figure 2 Golden gate cloning assembly |
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2004年，美国加利福尼亚大学旧金山分校的Kodumal等就利用IIs型限制性内切酶Bsa I和Bbs I对红霉素生物合成中6-脱氧红霉内酯B (6-deoxyerythronolide B，6-DEB)的所有合成模块进行碱基优化和克隆，组装成了一个连续的32 kb的聚酮合酶生物合成基因簇，并将其在大肠杆菌中成功异源表达[8]。2013年，中国科学院上海生命科学研究院的赵国屏研究组又利用一种可识别甲基化序列mCNNR (R=A or G)的IIs型限制性内切酶MspJ I，发展了一种甲基化辅助末端连接(Methylation-assisted tailorable ends rational ligation，MASTER)方法，并利用该方法成功组装完成了29 kb的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)放线紫红素生物合成基因簇[9]。
2 PCR技术
自从20世纪90年代PCR (Polymerase chain reaction)技术被用于基因合成以来，一系列依赖于PCR的DNA克隆和组装技术也逐渐发展起来了。例如重叠延伸PCR (Overlap extension PCR，OE-PCR)和环形聚合酶延伸克隆(Circular polymerase extension cloning，CPEC)技术，这些技术都可以解决上述典型和非典型酶切连接对于序列依赖的问题，达到无痕、非序列依赖性的效果。
2.1 OE-PCR技术
又称融合PCR，它是利用两个具有互补末端的引物，使两段PCR产物末端产生重叠序列，然后通过重叠序列变性退火形成互补双链，在DNA聚合酶的作用下进行延伸，最后再利用两端引物扩增产生完整的融合双链DNA[10](图 3)。该法操作简单， 周期短，已经广泛应用于基因克隆、定点突变和基因拼接等研究中[11]，而且国内外许多公司已经将其商业化。例如Stratagene公司研制的QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kits就是基于OE-PCR技术开发出来的进行基因定点突变的成熟试剂盒，并已经在许多研究工作中得到成功应用。如本研究组在探索兰卡杀菌素(Lankacidin)生物合成机制时，就利用该技术对可能参与其合成的两个脱水酶LkcB和LkcC中的活性催化位点进行定点突变，从而证明该脱水酶活性对于兰卡杀菌素的生物合成是必不可少的[12]。
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| 图 3 重叠延伸PCR技术组装流程Figure 3 OE-PCR assembly |
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相对于上述的非典型酶切连接而言，OE-PCR技术除需要依赖目的DNA片段末端序列产生重叠区外，整个PCR反应不受序列的限制，而且能够实现无痕连接，但却避免不了对DNA聚合酶高保真度的依赖。随着DNA片段长度的增加，PCR反应效率逐渐降低，引入错误的概率也逐渐升高，因此，难以通过该技术组装较大的DNA片段。
2.2 CPEC技术
与OE-PCR类似，CPEC首先利用具有互补末端的引物，使线性双链DNA片段和载体末端产生重叠序列，然后通过该具有末端重叠序列的线性双链DNA片段和载体经过变性和退火得到具有重叠末端的单链产物，最后彼此互为模板和引物，在DNA聚合酶的作用下进行延伸得到环状载体，得到的重组载体直接转化大肠杆菌，利用大肠杆菌体内的修复机制得到完整双链环状目的克隆[13](图 4)。这种方法最大的优势就是仅依赖于DNA片段之间以及片段与载体之间的末端重叠序列就可以简单高效地完成多个DNA片段的组装。但是由于该方法也依赖于PCR，当序列高度重复或G+C含量较高时，就难以保证组装的精确性。
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| 图 4 环形聚合酶延伸克隆技术组装流程Figure 4 CPEC assembly |
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3 同源重组技术
同源重组是指含有重叠序列的DNA分子之间或分子内部的重新组合，其已经广泛应用于分子生物学研究中。当操作较大的DNA分子时，DNA体外组装就会变得较为困难，这时就需要体内大片段DNA组装方法，例如目前最常用的酿酒酵母体内的转化耦联重组技术(Transformation-associated recombination，TAR)和大肠杆菌体内的Red/Rec同源重组技术。
3.1 TAR技术
TAR是利用酿酒酵母体内高效的同源重组系统实现多个具有末端重叠序列的DNA片段的一步组装方法[14](图 5)。它不仅能够方便地将较短的DNA片段组装成较长的DNA片段[15]，甚至还能够实现整个基因组的组装。
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| 图 5 TAR技术组装流程Figure 5 TAR assembly |
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早在2008年，美国J. CraigVenter研究所的Venter研究组就在酿酒酵母中通过该技术完成了生殖道支原体(Mycoplasma genitalium)基因组(582 970 bp)的最后一步组装[16]。2009年，他们又对其进行了改进，将25个具有末端重叠序列的片段(17−35 kb)及一个线性化的载体在酿酒酵母中直接组装成一个携带该基因组的环形质粒[17]。同样，他们在2010年利用酿酒酵母同源重组系统完成了1 078条大小为1 080 bp的DNA片段的组装，最终人工合成了1.08 Mb的丝状支原体(Mycoplasma mycoides)基因组[18]。
酵母体内的同源重组是到目前为止最高效的DNA大片段的组装方法，在合成更长的DNA片段如基因组时有较大的优势。同时，TAR克隆经过多年的发展、改进，已经成为一种成熟的技术，也已经应用到多个领域，但是它也有自身的不足。例如，当克隆大于250 kb的DNA片段时，DNA断裂将成为一个重要的限制因素；当克隆区域富含重复序列时，可能会在酵母有丝分裂过程中发生片段缺失；当克隆区域富含GC时，也难于在酿酒酵母中准确克隆。
3.2 Red/Rec技术
Red/Rec技术是一种基于λ噬菌体Red操纵子和Rec噬菌体RecE/RecT同源重组系统的DNA克隆技术。Red同源重组系统主要由Exo、Beta、Gam蛋白组成，分别由λ噬菌体exo、bet、gam基因编码。其中，Exo具有5′→3′双链核酸外切酶活性，能够形成末端DNA单链；Beta是单链结合蛋白，能够促进DNA分子间退火；Gam能够阻止单链DNA片段的降解，提高单链DNA分子的稳定性，从而间接提高同源重组的效率。Rec同源重组系统中除上述Gam蛋白外，Rec噬菌体编码的RecE和RecT蛋白也能高效促进同源重组[19]。
相对于线型-线型同源重组(Linear-linear homologous recombination，LLHR)而言，Red/Rec同源重组系统对于线型-环型同源重组(Linear- circular homologous recombination，LCHR)更为高效(图 6a)。目前，在大肠杆菌中进行基因敲除最常用的PCR-targeting技术就是依赖于λRed系统介导的LCHR发展起来的[20]。
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| 图 6 λRed介导的LCHR(A)和全长的RecE/T介导的LLHR(B)Figure 6 LCHR mediated by λRed (A)and LLHR mediated by full-length RecE/T (B) |
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2012年，德国亥姆霍兹药物研究院的Müller研究组证明了全长的RecE蛋白和RecT能够高效促进线型-线型同源重组(图 6b)，并利用该策略克隆了10个来自无色杆菌(Photorhabdus luminescens)的生物合成基因簇(10−52 kb)，同时对其中两个成功进行了异源表达[21]。此方法与传统的文库构建、筛选获得含目的DNA片段的方法相比，大大简化了筛选流程，而且由于文库构建具有随机性、包装容量有限，通常难以直接得到含完整目的DNA片段的载体，而全长的RecE/T则能更容易获得全长的目标基因簇。但是，相对于上述的TAR技术而言，全长的RecE/T介导的LLHR只能克隆中等尺度的DNA大片段，而TAR则可以组装更大尺度的DNA片段，甚至基因组。
4 单链退火拼接技术
单链退火拼接技术，即所谓的Chew-back组装[22]，是指创造DNA分子之间的重叠区，通过连接或聚合的思想实现分子间的拼接。这种技术既跳出了限制酶的使用，利用DNA外切酶产生了较长的黏性末端；又应用等级化组装模式很好地规避了逐级添加的耗时耗力与一次性组装可能不正确的拼接，使得无论在组装的DNA片段数目还是尺度上变得更为高效。例如目前最常用的Gibson assembly和SLIC技术。
4.1 Gibson assembly技术
Gibson assembly技术又被称为“Gibson恒温一步组装法”，是美国J. CraigVenter研究所的Gibson等创建的一种DNA组装方法[23]，即利用T5核酸外切酶、DNA聚合酶及连接酶的协同作用在体外将多个带有末端重叠序列的DNA片段组装起来。其中，T5核酸外切酶具有5′→3′核酸外切酶活性，能够从5′端切割有重叠区的DNA片段产生3′突出末端，然后该单链DNA的重叠序列在50 °C特异性退火(此时T5核酸外切酶逐渐失活)，最后DNA聚合酶和Taq连接酶修复连接而成的双链DNA，从而形成完整的DNA分子，实现无缝拼接(图 7)。
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| 图 7 Gibson拼接组装流程Figure 7 Gibson assembly |
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在2008年，Gibson等在构建生殖道支原体基因组时，首先采用自创的体外变温两步组装法获得了支原体1/4大小基因组[16]，然后对该技术进行改进，将这4个超过100 kb的片段在体外组装成了完整的583 kb的生殖支原体基因组。2010年，Gibson研究组又通过条件优化将600个带有20 bp重叠序列的60 bp的寡核苷酸在体外成功人工组装合成了16.3 kb的小鼠线粒体基因组[24]。
由此可见，Gibson拼接技术可以简单快速地实现多个DNA片段的一次性无缝组装，而且组装尺度非常可观，现已成功组装的最大的DNA分子大小为1.08 Mb。但是随着一次组装的DNA片段的增多，其效率和正确率也会随之降低，而且需要的重叠序列也较长，引物合成的费用也相应增加。
4.2 SLIC(Sequence and ligation-independent cloning)技术
SLIC是一种不依赖于序列和连接反应的克隆方法[25]，主要利用T4 DNA聚合酶在无dNTPs存在的情况下发挥3′→5′核酸外切酶活性，将DNA片段消化产生含有末端重叠序列的5′黏性末端，然后DNA片段之间或DNA片段与载体之间依靠重叠序列退火(Rec A可提高重组效率)，形成环状中间体，最后直接转化大肠杆菌感受态细胞，利用大肠杆菌本身的修复系统修复成完整的环状重组质粒(图 8)。2009年，美国哈佛医学院的StephenElledge研究组利用SLIC实现了9个含40 bp末端重叠序列的DNA片段(275−980 bp)的一步拼接[26]。
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| 图 8 SLIC标准流程Figure 8 SLIC assembly |
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SLIC拼接法不需要连接酶，也不需要考虑插入的DNA片段本身的序列，可以实现多个DNA片段的一次性组装，是构建生物合成途径的一个有效技术。目前，国外许多公司已经将其商业化，例如Novagen公司的RadianceTM系统和Invitrogen公司的GatewayTM系统都是基于此技术开发出来的。相对于上述Gibson assembly技术而言，SLIC只需要一种酶(T4 DNA聚合酶)即可完成多片段组装，而Gibson assembly则需要T5核酸外切酶、DNA聚合酶及Taq连接酶的协同作用。但是该技术只能组装中等尺度的DNA片段，而Gibson assembly则可以组装高达580 kb的DNA大片段。
此外，In-FusionTM Cloning[27]也是一种与SLIC类似的不依赖于连接反应的组装技术，不同的是In-FusionTM Cloning使用的是一种功能类似的牛痘DNA聚合酶而非T4 DNA聚合酶，而且它只需要15 bp的重叠序列，而SLIC则需要至少40 bp的重叠序列。
5 总结与展望
综上所述，DNA克隆与组装技术正处于一个快速发展的阶段，除了本文中提到的一系列DNA组装技术以外，许多其他技术也快速发展起来。依赖于位点特异性重组酶的位点特异性重组(Site-specific recombination)可以对DNA片段进行一次性组装[28, 29]，而且不会进入任何错误；依赖于特异性切割尿嘧啶的试剂的USER cloning[30]也是一种常用的DNA拼接技术；依赖于单链退火拼接的一种连接酶循环克隆技术LCR[31]是一种高效高通量的体外DNA一步拼接法；枯草芽孢杆菌体内重组方法的发展也使其成为组装基因组等大片段的候选底盘生物。此外，用于从特异性和非特异性PCR产物中克隆特异性目的片段的Quick and clean cloning技术[32]以及用于将外源DNA片段插入到目的载体的任何一个位置的Restriction-free cloning[33]和Transfer-PCR cloning[34]都是一些我们可以借鉴的DNA克隆技术。
当然，无论是非典型酶切连接技术还是依赖于PCR的技术，无论是体内的同源重组技术还是体外的单链退火拼接技术，目前还没有一个理想的组装方法可以同时满足无序列依赖性、无痕、可按预设顺序进行快速平行组装，并同时适用于基因、生物合成途径甚至是基因组的组装。不同的组装技术具有不同的适用性，通常的策略都是几项技术的联合使用。同时，要根据组装的DNA分子尺度、能否容忍DNA片段连接处“疤痕”的存在及组装序列的同源性程度等选择最适合的方法。
毋庸置疑，未来的DNA组装将大大受助于计算机软件，美国联合生物能源研究所就针对相邻片段之间序列依赖性的模块化理解开发了一个专门的软件包J5，能够结合软件利用机器人进行自动化组装[35]。相信在可预见的未来，DNA合成将会更加快速、高效而廉价，大规模基因组的合成将会成为现实；DNA组装技术也会更加成熟，很可能作为现代分子克隆技术的一个重要工具得到广泛的应用。
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