干扰RNA-基因沉默

干扰RNA进行基因沉默的原理和方法：

越来越多的实验室利用 siRNA 敲低技术来评估细胞内蛋白质的功能。这项技术常被用于确定从细胞中去除蛋白质之后所产生的影响：

• 是否导致细胞死亡？是否为致死敲除？
• 是否影响其它蛋白质（尤其是信号转导通路中的蛋白质）的表达水平？
• 是否影响其它蛋白质在细胞中的位置？
• 对细胞表型、形态和功能产生哪些影响？

RNAi：

英文全称为 RNA interference，中文名为 RNA 干扰，这是一种在进化上高度保守的基因表达调控机制，能引起基因沉默。

siRNA：

• 小干扰 RNA (siRNA ， small interfering RNA / short interfering RNA siRNA） 是由 20-25 个核苷酸组成的双链 RNA 分子，在细胞中具有多种功能。在 RNA 干扰 (RNAi) 通路中，siRNA 通过与互补 mRNA 分子杂交干扰基因表达。这种干扰会触发 mRNA 降解，进而抑制特定基因的基因表达。
• 经典的 RNAi 通常由短双链 RNA 触发，这段短双链 RNA 就称为小干扰 RNA。siRNA 能装载到RISC复合物（RNA-inducing silencing complex）上，并且结合到与其序列同源的靶 mRNA 上，使靶 mRNA 降解。在这过程中，真正使 mRNA 发生降解的东西其实是 RISC复合物中能切割核酸的组分，而 siRNA 只不过是个引路人，通过序列特异性的识别，把 RISC 复合物引导到靶 mRNA上。正是因为这种序列特异性的识别机制，我们就可以根据靶 mRNA 的序列来设计 siRNA 序列，利用这么一个特异的 siRNA 来沉默靶 mRNA。

shRNA：

siRNA 呢，是由短发夹 RNA（short hairpin RNA，shRNA）为原料加工得来的，所以 shRNA 是 siRNA 的前体。这样理了一下，我们就可以知道，RNAi 是一种现象，一种基因沉默的作用机制，siRNA 和 shRNA 都是具有一定结构特点的 RNA 序列。siRNA 和 shRNA

作用原理

1. 利用短寡核苷酸 siRNA 或能够转录 siRNA 的 DNA 质粒将双链 RNA (dsRNA) 引入细胞。
2. 细胞中的 Dicer 蛋白将 dsRNA 消化为 21 bp 的 dsRNA (siRNA)。
3. siRNA 被整合到 RNA 诱导沉默复合体 (RISC) 中。
   在 RISC 复合体中，dsRNA 发生链分离。其反义链与细胞中的互补/靶 mRNA 杂交。
4. 活化 RISC 中的核酸酶降解靶 mRNA。
5. 断裂的 mRNA 无法翻译成蛋白质。也就是说蛋白质无法表达，从而成功“敲除”蛋白质。

优化 siRNA 序列，实现最佳敲除效果

• 许多在线程序都可帮助您从待敲低蛋白质的 mRNA 序列中选择最合适的 siRNA 序列。
• 这些计算机程序根据以下标准从蛋白质的完整 mRNA 序列中筛选 21 bp 的序列：

1. 位于起始密码子 AUG 50-100 个核苷酸范围内的序列，或位于终止密码子 50-100 个核苷酸范围内的序列（确保转录基因为沉默状态）。
2. siRNA 序列以 AA 开始（以便在反义序列的 3’ 端形成 dTdT 结构），这样可降低合成成本并提高 siRNA 双链体的核酸外切酶活性抗性。
3. GC 含量：理想的 GC 含量为 < 50%（大多数软件的默认范围为 40% 至 50%）。
4. 延伸核苷酸重复序列。
   避免使用含有 3 个或 3 个以上重复 G' 或 C' 的序列（
   这种序列会引起分子内二级结构的形成，影响杂交效果）。
5. BLAST 检索（避免“脱靶”）

• 选定靶序列之后，进行 BLAST 检索确保靶序列与其它基因序列不同源。
• 一般而言，从程序给出的 siRNA 序列中选出 3 个得分最高的序列进行 BLAST 检索，这样得到有效序列的几率较高。
  请注意：期刊编辑审稿时通常都会要求作者提供 BLAST 检索信息。
• 组合使用 — 从 3 个 siRNA 开始，逐步缩小范围，最后锁定其中 1 个。
• 还可以一次性敲除 2 个以上基因，但首先要分别对其进行优化。

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资源

· 免费在线 siRNA 设计和 Flash 教程。

· 国家生物技术信息中心提供了生物医学信息和基因组信息的访问入口，您可从中获取所选靶蛋白的 mRNA 或 cDNA 序列。

· UCSC 基因组网站上的 Blat 工具。

参考：https://www.abcam.cn/protocols/recommended-checks-and-controls-for-sirna-experiments