LacZ DNA 标记的腺病毒在高氧性肺损伤基因治疗中的转染和致炎作用
【摘要】 目的观察LacZ DNA 标记的腺病毒在高氧性肺损伤基因治疗中的转染和致炎作用。方法装载LacZ DNA 的腺病毒在小鼠高氧模型开始前2天经鼻腔送入体内，X-gal 染色和β-半乳糖酶活性测定用于确定LacZ DNA在肺内转染的分布及其蛋白表达产物的活性；小鼠肺干/湿重比和支气管肺泡盥洗液（BALF）内的蛋白浓度的测定用于鉴定腺病毒在基因治疗过程中可能存在的致炎作用。结果X-gal 染色显示LacZ DNA在高氧前及后均可广泛转染在肺各级支气管和肺泡上皮细胞，β-半乳糖酶活性的测定提示了LacZ DNA 可成功地翻译成其蛋白质表达产物并表现为高表达；同时，腺病毒的致炎作用在高氧吸入48h后示小鼠肺干/湿重比和BALF蛋白浓度均较其他对照组明显升高，但其升高的程度可在24h后迅速缓解上升趋势。结论腺病毒为载体的基因治疗可有效地转染标记基因，同时，腺病毒虽在基因治疗的过程中有一定的致炎作用，但是暂时的，其仍是有效的DNA载体。
【关键词】 腺病毒；基因治疗；LacZ;高氧性肺损伤；载体
[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of gene transfer and endogenous inflammation of adenovirus marked by LacZ DNA to hyperoxia lung injury in gene therapy. MethodsAdenovirus encoded LacZ DNA was intranasal administered to mice at 2 days earlier before 100%O2 inhalation, X-gal staining and activity measurement of β-gal protein translated from LacZ DNA were applied to determine the level of LacZ DNA transfer and it's protein expression; meanwhile, mouse lung wet/dry ratio and protein concentration in bronchus alveolar fluid were measured to valuate the degree of inflammation reaction from adenovirus.ResultsX-gal staining showed LacZ DNA could transfer broadly in series of lung bronchus and alveolar epithelial cells no matter before or after 100%O2 inhalation; β-gal protein activity measurement presented LacZ DNA could successfully translated into it's protein expression with high level expression; meanwhile, endogenous inflammation of adenovirus showed mouse lung wet/dry ratio and protein concentration in bronchus alveolar fluid were significantly increased at the 48h of 100%O2 inhalation compared to control groups, but lost the pattern of continue increasing after anther continual 24 h of 100%O2 inhalation.ConclusionBeing vector of gene therapy, adenovirus could successfully transfer target DNA, while, adenovirus would bring some degree of endogenous inflammation, but it is temporarily, it is still a validity vector in gene therapy.
[Key words]adenovirus;gene therapy;LacZ;hyperoxia lung injury;vector
基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因通过载体导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。携带基因进入细胞内表达的载体有病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体又分腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒载体等；非病毒载体包括脂质体、磷酸钙、基因枪等。腺病毒是基因治疗的主要载体，并占所有基因治疗研究中的28%[1,2].急性肺损伤（ALI）是严重威胁生命安全的常见急危重症，其病死率在我国高达60%——70%.传统的ALI治疗方案对挽救生命和疾病转归影响有限[3],因此，尝试新的治疗手段如基因治疗已是目前研究的热点。然而，关于腺病毒自身的致炎作用在以其为载体的基因治疗对ALI治疗效果影响的报道尚少见。本研究在建立小鼠ALI疾病模型的基础上，观察了腺病毒的转染和致炎作用对小鼠ALI基因治疗效果的影响及意义。
1材料与方法
1.1材料动物：本所研究使用的小鼠均获得美国宾夕法尼亚大学动物部批准。小鼠随机性分为4组：（1）氧气吸入前对照组（Con组）15只；（2）LacZ DNA 标记的腺病毒治疗组（AdLacZ组）20只；（3）磷酸盐缓冲液（PBS）治疗组（PBS组）20只；（4）无治疗组（无治疗组）20只。
1.2方法
1.2.1经鼻腔通道的治疗方法在100% O2暴露前2 天，根据小鼠体重将腺病毒浓缩制剂用缓冲剂调整到每只小鼠给药50 μl,并将总容量分为4次在小鼠医学专用状态下呈垂直位时经鼻腔吸入。
1.2.2高氧性肺损伤模型各组小鼠随机取样后，将他们同时暴露于100%O2灌注的氧舱内以制造高氧性肺损伤动物模型。氧舱内氧流量为6——8 L/min,舱内氧气交换频率是6——7次/ h,CO2<0.2%,湿度约45%,并维持约12h的白天黑夜交替。在100% O2吸入后的24、48和72h,分别收集肺组织和肺泡灌洗液等标本以备检测之用。
1.2.3标本的收集和处理在高氧吸入前及后的24、48和72h,应用苯巴比妥（50mg/kg）腹腔深度医学专用小鼠后，暴露小鼠主气管并行气管插管和机械通气。沿胸腹中线切开皮肤和腹部皮下组织以暴露腹腔脏器和腹主动脉。隔断腹主动脉放血以减少肺部血流量，随后，打开胸腔，分离心脏及肺旁结缔组织，并经右心室穿刺，肺泡灌流液以20——30cm H2O（1cm H2O=0.098 kPa）水压经右心室灌流肺组织，至肺组织内血液冲洗干净。分离出的肺组织在液氮中快速冷藏，并将肺标本保存在-80℃的冰箱内以备用。另外，在机械通气后及肺泡灌流之前，用注射器灌洗肺泡3次，并收集支气管-肺泡灌洗液。灌洗后的肺组织经由主气管灌入4%的甲醛溶液至肺泡内以备用于肺组织的细胞化学染色。
1.2.4 X-gal染色β-半乳糖酶（X-gal）染色[4 ]可以提供LacZ DNA整合到肺上皮细胞DNA后的蛋白表达分布的影像学分析。新鲜整体肺组织在福尔马林液内固定并彻底漂洗后，在X-gal复合试剂（K4Fe（CN）6-3H2O,K3Fe（CN）6,2mM M
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