Iso-Seq3|三代全长转录组分析

Iso-Seq 3

大家都知道全长转录组（Full-length transcriptome）是基于PacBio和Nanopore三代测序平台，它的优势在于无需打断拼接，直接获得包含5’UTR、3’UTR、polyA尾的mRNA全长序列及完整结构信息，有利于解决二代转录本重构准确率低的问题，从而准确分析有参考基因组物种可变剪接及融合基因等结构信息，克服无参考基因组物种转录本拼接较短、信息不完整的难题。同时还可以借助二代测序数据，进行转录本特异性表达分析，获得更加全面的注释信息。

而Iso-Seq3是最新的三代全长转录组分析软件，它包含用于识别PacBio单分子测序数据中的转录本的最新工具。

Iso-seq 3使用方法如下：

1 ccs(Circular Consensus Calling)
ccs 获取一致性的序列，要求每一条测序的reads至少有一端含有引物序列。

ccs test.subreads.bam ccs.bam  --noPolish --minPasses 1

2 测序引物和barcode的去除
这一步是采用lima 来完成的，这个软件也是官方最新开发出来的程序，速度和准确度都较以往的算法有了很大的提升。还能够基于barcode序列区分不同的样品，

lima ccs.bam barcoded_primers.fasta  demux.ccs.bam --isoseq --no-pbi

3 聚类(cluster)
聚类采用IsoSeq3 软件来完成，这一步会首先将ployA尾巴去除掉，并将连环结构去除掉，再对相似的序列进行聚类，最好形成全长的reads。

isoseq3 cluster demux.primer_5p--primer_3p.bam  unpolished.bam --verbose

4 抛光(polish)
这一步主要是将聚类的转录本，合并成一个完整的一致性序列。

isoseq3 polish -j 16 unpolished.bam  test.subreads.bam   polished.bam

END

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