文献
2023
Mol. Biol. Evol.
Genomic Insights into Adaptation to Karst Limestone and Incipient Speciation in East Asian Platycarya spp. (Juglandaceae)
课题背景
（1）趋同进化指不同的谱系独立地进化出相似的特征，在动物和植物中都很普遍。
（2）喀斯特土壤的钙镁含量以及pH更高，蓄水能力降低，是用来探索适应性进化和物种形成的天然实验室。喀斯特土壤的多种草本植物已被要来研究适应性机制，对于木本植物的研究仍不足。
Fig 1a
（3）圆果化香(Platycarya longipes)属于胡桃科(Juglandaceae)是喀斯特森林中常见的优势种，耐钙盐。其唯一的同属物种化香树(Platycarya strobilacea)分布广泛。由于其在形态和生境上的显著差异（Fig 1a），圆果化香和化香树在喀斯特适应、趋同进化和物种形成研究中具有重要的应用前景。
亮点
Fig 1b
本文作者关注以下三个问题：
（1）圆果化香(Platycarya longipes)更适宜喀斯特生境的机制是什么？
（2）圆果化香(Platycarya longipes)的喀斯特适应多大程度上推动了与化香树的分化？
（3）在喀斯特生境的木本和草本是否存在趋同进化？
为了回答以上问题，作者组装了圆果化香和化香树基因组，并对85份圆果化香和122份化香树进行了全基因组重测序（Fig 1b）。
结论1 圆果化香和化香树的基因组组装
Fig 1c
Fig S1f
作者组装并注释了高质量的圆果化香(P. longipes)和化香树(P. strobilacea)的基因组（Fig 1c），通过共线性分析发现圆果化香和化香树的14号染色体前半部分与普通胡桃(J. regia)的14号染色体对应，而另一半与15号染色体对应（Fig S1f），这表明在胡桃科的祖先物种中，染色体融合通过end–end translocation 产生。
结论2 种群历史揭示了两物种分化过程的不对称迁移
Fig 2a-b
重测序数据都比对到化香树的参考基因组上。
STRUCTURE分析的最佳K值为2，部分个体出现混合（Fig 2a），基于SNP构建的进化树揭示了两个主要的进化分支——圆果化香和化香树，以及一个混合分支（Fig 2b）。
Fig 2c-e
主成分分析也表明，圆果化香和化香树为两个独立的物种（Fig 2c），有一些个体出现混合，但并非另一个物种的祖先。两者的群体分化指数为0.479±0.161，绝对核苷酸多样性差异为0.009±0.003.
圆果化香的全基因组杂合度更低，近交系数更高。这些观察结果支持了圆果化香的喀斯特适应性导致该物种的分布范围受限且分散的观点。
PSMC分析揭示，两个物种的有效群体大小在大约200万年前之前非常相似，暗示了它们之间可能存在的分歧时间。随后，化香树的有效种群大小在大约100万年前稳定，而圆果化香的有效群体大小继续增加，并在大约50万年前达到最高点（Fig 4d）。
为了进一步研究种群的人口历史，作者在IMa3中采用了隔离与迁移（IM）模型，使用了200个独立的非编码位点。IMa3的结果表明，这两个物种在大约209万年前分化，两个物种之间存在不对称的双向基因流（Fig 2e）。估计的圆果化香P. longipes和化香树P. strobilacea的有效群体大小分别为36,329和16,591，两者都高于它们的共同祖先（Ne_anc = 4,923）。
结论3 自然选择导致了两物种的分化
Fig 3a-b
在整个基因组中，大部分非重叠的25 kb窗口都显示出高度群体分化，加权平均群体分化指数为0.479±0.161（Fig 3a）。为了评估中性历史人口对这一模式的贡献，作者基于从IMa3估计的隔离与迁移模型，在MS软件中进行了50万次合流模拟（coalescent simulations）。通过将观察到的群体分化指数分布与模拟得到的预期分布进行比较，结果显示出一个更平坦的分布，其极高值和极低值更加显著（Fig 3a）。
具有最高群体分化的窗口被鉴定为基因组分化的岛屿，它们更集中在染色体的中段和末端附近（Fig 3b）。
Fig 3c-d
与对照相比，这些高分化区域的Dxy（对核苷酸多样性绝对差异的量度）和种间共享多态性比例显著降低（Fig 3c）
Fig 3e-g
此外，这些区域的多态性水平显著降低，等位基因频谱向稀有等位基因倾斜，连锁不平衡信号更强（Fig 3d-f）。这些结果表明，基因组遗传分化是由于种内遗传多样性的降低而不是种间绝对遗传距离的增加。此外，异常高或异常低的种间分化区域，重组率被显著抑制（ Fig 3g）。
Fig S3a
此外，作者发现群体分化指数于两物种的重组率成负相关（Fig S3a）。综上所述，这些结果表明自然选择可能在物种分化中起主导作用。
（证据似乎不够。。。）
结论4 基因拷贝数变异是圆果化香适应喀斯特土壤的机制
Fig 4a-b
基因的拷贝数变异（CNV）对生物适应性进化起重要作用，之前的研究发现，CNV的突变率远高于单碱基突变。因此作者研究了全基因组复制事件（WGD）和串联重复在圆果化香适应喀斯特图中过程的机制。
和之前的发现一致，化香树属与胡桃科共享同一个古老的全基因组复制事件（Fig 4a）。序列同源性分析表明，327,237个基因聚类到23,452个家族中，其中所有的11种被子植物共有8,868个家族，圆果化香特有130个家族（Fig 4b）。
Fig 3c-d
与最近共同祖先相比，圆果化香有46个基因家族显著扩张，共包含了305个基因（Fig 4c），这些扩张的基因主要来自于串联重复，这支持了两个物种最近的分化。此外，作者在圆果化香中鉴定到73个基因家族发生显著收缩，仅剩186个基因，而在化香树中，这73个家族对应了768个基因。
通过GO富集发现，圆果化香中扩增的家族显著富集到18个GO term。通过KEGG富集发现，这些扩张的家族显著富集到14条通路（Fig 4d），其中三条与环境适应有关。考虑到基因拷贝数变异经常与分子表型有关，作者假设这些途径在圆果化香的适应性进化中起重要作用。（也有些牵强。。。）
结论5 TPC1A的正选择是圆果化香适应喀斯特土壤的基础
Fig 5a
为了研究圆果化香在喀斯特环境中适应的基础，作者进行了全基因组筛选，以确定潜在的在喀斯特环境中起作用的位点。通过严格的正选择分析，共确定了178个25kb的窗口（Fig 5a），这些窗口很可能在圆果化香中处于正选择状态。对这些区间内的基因做KEGG 富集分析发现主要涉及钙离子内流和应激过程。进一步研究这些区域，作者鉴定出了7个基因表现出最强烈的正选择，分别是TPC1A、CNGC1、NIPA6、MED8、PPIP5K1、SRP19和TCP12，这些基因与应激、生殖和发育相关（Fig 5a）。
Fig 5b-c
TPC1是胡桃科共有的基因家族，包括TPC1A和TPC1B两个成员，通过WGD产生。作者检查了TPC1A基因邻近的DCMS、pi、Tajima’s D、CLR、XP-EHH以及Dxy信号，都表现出强烈的受选择（Fig 5b，Tajima’s D和CLR并不是很明显）。该基因所在的区域在圆果化香和化香树之间的群体分化指数为0.522，并且圆果化香存在明显更低的遗传多样性。
为了进一步研究胡桃科中 TPC1A 基因的进化关系，作者使用圆果化香和化香树中已测序的完整蛋白序列构建了一个系统发育树，以普通胡桃(J. regia)为根节点。结果显示，所有圆果化香样本形成了一个单系群，在化香树内部嵌套（Fig 5c），这表明圆果画像的TPC1基因起源于化香树。
Fig 5d
TPC1是一种在所有陆生植物中普遍存在的钙离子内流通道，在单双子叶植物中功能保守。为了进一步研究该基因在圆果化香中的适应性机制，作者构建了它的系统发育关系（Fig 5d）。
进化树显示，包括生长在不同土壤类型的唇柱苣苔属植物在内的唇形目植物，聚集成了一个高度保守的单系群，而化香树属植物则与其他壳斗目植物一起聚集成另一个单系群。这表明 TPC1 的适应性进化在这两个喀斯特类群中是独立发生的。
通过对圆果化香和化香树的TPC1A基因进行单倍型分析，发现在整个基因长度（47,529 bp）上有396个SNPs，其种间群体分化指数超过0.5。在这些SNP中存在被前人鉴定到的错义突变。这些变异可能导致了TPC1(A)基因的功能改变，并导致了不同的喀斯特环境适应能力。由于TPC1基因在两个亲缘较远的分类群中存在于同一基因的不同位点，因此作者认为TPC1基因代表了喀斯特生境植物基因水平趋同进化的一个例子。
结论6 转录组数据证明圆果化香对高钙镁盐的响应能力强于化香树
Fig 6
最后，作者对圆果化香和化香树的根茎叶在高钙镁盐处理0-6h-1d-7d的材料进行转录组测序（Fig 6a）。
首先，作者比较了同一气候条件下的自然群体在经历高钙镁盐胁迫后的差异表达基因。圆果化香的叶片相对于化香树有4296个上调的DEGs和1420个下调的DEGs，圆果化香的根相对于化香树有856个上调的DEGs和913个下调的DEGs.圆果化香叶片上调的DEGs显著于高钙适应以及离子跨膜运输相关（Fig 6b）。
然后，作者用实验室材料检测了圆果化香和化香树的各部位在经历高钙镁盐胁迫时的转录变化，值得注意的是大部分差异表达基因在两物种中是共有的。进一步分析发现圆果化香有78个基因受高钙镁盐诱导的表达弹性更强，这可能帮助了圆果化香对喀斯特环境高钙镁盐的适应。
最后，作者比较了圆果化香和化香树的基因共表达模块。圆果化香有37个共表达模块（其中有9个是其特有的），化香树有48个。通过对模块进行功能分析发现，9个圆果化香特有的模块与伤害反应相关。
此外，作者发现对于圆果化香和化香树，前面鉴定到的受强烈正选择的TPC1A基因表达没有差异，但是另一个TPC1B在处理6h和1d的茎中发现显著上调，并且圆果化香上调更明显（Fig 6c）。对578个与TPC1B共表达的基因进行评估发现其中的190个在两物种中存在差异表达（Fig 6d-e），这表明在圆果化香中TPC1B及其共表达基因在高钙下调控钙离子内流方面更活跃。这些发现为TPC1参与圆果化香喀斯特环境适应提供了依据。
综上所述，在高钙镁处理下，圆果化香中TPC1及其共表达基因的转录是不同于化香树的（Fig 6f），这一研究结果揭示了圆果化香的生理适应和转录可塑性的变化，有助于我们理解植物对喀斯特环境的适应。
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