组间差异分析：Anosim

无论是野外环境样品，还是室内试验样品，一般我们都会设置样方或平行样来增强分析的准确性，必要时还会进行区组设计，因此在数据分析中需要进行组间差异的比较判别。然而对于微生物群落数据，由于物种繁多，而且不同物种的敏感环境因子不同，因此基于正态分布的参数检验难以满足分析需要，要进行多元非参数检验（non-parametric multivariate statistical tests）来计算显著性，R语言vegan包含有多种非参数检验方法，包括Anosim、Adonis、MRPP等，不同方法在统计量的选择、零模型等方面存在差异。

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Anosim分析（Analysis of similarities）是一种基于置换检验和秩和检验的非参数检验方法，用来检验组间的差异是否显著大于组内差异，从而判断分组是否有意义。Anosim分析使用距离进行分析，默认为method="bray"，可以选择其他距离（和vegdist()函数相同），也可以直接使用距离矩阵进行分析。在R中我们可以使用vegan包中的anosim()函数进行分析，这里我们微生物群落数据为例进行分析：

#读取抽平后的OTU_table和环境因子信息

data=read.csv("otu_table.csv",header=TRUE, row.names=1)

envir=read.table("environment.txt",header=TRUE)

rownames(envir)=envir[,1]

env=envir[,-1]

#筛选高丰度物种并将物种数据标准化

means=apply(data,1, mean)

otu=data[names(means[means>10]),]

otu=t(otu)

#根据地理距离聚类

kms=kmeans(env,centers=3, nstart=22)

Position=factor(kms$cluster)

#进行Anosim分析

library(vegan)

anosim=anosim(otu,Position, permutations=999)

summary(anosim)

上图中的ANOSIM statistic R为Anosim检验的统计量，他的分布衡量的就是零模型的分布，Upper quantiles of permutations就是通过999次置换获得的统计量的分位数。具体说来，Anosim分析的原理是先计算样品两两之间的距离，将样品两两之间的距离按照从大到小进行排序并计算排名（秩，r），并根据距离的归类（属于组间距离还是组内距离）来计算组间距离秩的均值rb与组内距离秩的均值rw之差作为统计量：

假如R>0，说明组内距离小于组间距离，也即分组是有效的，这与方差分析中比较组内方差与组间方差来判断的原理是类似的。由上面分析结果可以看到R=0.4613，大于零模型99%分位数0.290，因此p值为0.001，结果是显著的。我们可以提取分析结果，如下为距离的秩：

因为有22个样品，所以应该有C(22, 2)=231个距离。如下为上述距离对应的归属：

现在我们根据这个排序归类进行可视化：

设置参数notch=TRUE后会在箱子的两边绘制凹槽来显示中位数的置信区间，从而便于对中位数进行比较。可以看出第二组分组效果较差，但总体来说分组是有效的。