吐槽达人再次上线！最近在分析WGBS，跳了很多坑！为什么很多的比对软件默认只对CpG排序？我们大植物领域CHG和CHH同样重要！好吗？好的！今天就我在分析甲基化过程中遇到的一个参数问题，写一下，供大家参考，尤其是做植物的小白们。
三代测序数据，分析起来说难也不难，无非就是建索引，比对，然后call自己想要的东西。甲基化的分析软件很多，bismark是一个经典的比对软件，至于怎么用，我会在文末附上参考的大神们的简书，一看便知。今天只讲一些小坑。
DNA甲基化，与癌症息息相关。因此在动物中研究的很多，而动物和植物中存在着不小的差别，最重要的就是动物中的甲基化类别是CpG，而在植物中，除了CpG之外，CHG和CHH同样是很重要的。但是一些分析软件默认是CpG，需要我们加上一些参数才可以对CHG和CHH进行下一步分析。
./bismark_methylation_extractor -s --gzip --bedGraph --buffer_size 10G --cytosine_report --comprehensive --genome_folder ~/PATH/to/GRCh38/test_data_bismark_bt2.bam 2>extracor.log
这是某位大神的抽提甲基化位点的参数设置，用此参数，基本上可以获得所有想要的数据，包括CHH_context，CHG_context，CpG_context。但是在排序得到.bedGraph.和.cov文件时，默认只对CpG_context文件进行排序。若想得到CHH和CHG的.cov文件，需要加一个参数。如下：
./bismark_methylation_extractor -s --gzip --bedGraph --CX --buffer_size 10G
--cytosine_report --comprehensive --genome_folder ~/PATH/to/GRCh38/
test_data_bismark_bt2.bam 2>extracor.log
对，就是--CX，这个参数可以同时对CHH_context，CHG_context，CpG_context进行排序，得到.cov和.CX_report文件。此类文件是用DSS包call DMR时的输入文件，只要用shell稍微改一下格式就可以用，后面也会附上另一位大神使用DSS包的方法。
上图就是加了--CX之后的输出的report文件，每一列分别代表染色体，位置，正反链，甲基化位点数目，未甲基化位点数目，甲基化类型，以及甲基化类型对应的碱基。
如果你已经入坑了，也就是说没有加--CX，但是重新跑又特别费时间，怎么办？简单！下载bismark的时候，有没有发现一个叫bismark2bedGraph的脚本？在这里，这是个神奇的脚本，只需要输入下面这一行命令：
./bismark_v0.22.1/bismark2bedGraph --CX -o output_name CHG_context_your_file_name_bismark_bt2_pe.txt.gz
--CX不能少啊，不然还默认只能对CpG排序。做植物的太不容易了！上述命令是对CHG进行排序，CHH也是一样的操作。
好了，这样就可以对生成的.cov文件稍微搞一下，用DSS包call DMR吧。
个人建议还是第二种方法好一点，在获得DSS包的输入文件时，第一种方法用.report文件提取比较方便，第二种方法是用.cov文件提取比较方便
祝君顺利！
reference：
bismark使用参考简书：https://www.jianshu.com/p/5d7e550abc1a
DSS包使用参考简书：https://www.jianshu.com/p/203ac75c0c32
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