2019-01-10

接1月9日

（3）PBAF复合物调控B16F10肿瘤细胞对T细胞介导的杀伤的敏感性的分子机制.

方法：提取PBAF缺陷型B16F10细胞的总RNA，进行RNA-seq检测分析PBAF缺陷型B16F10细胞的转录组。RNA-seq数据做基因富集分析，目的在于观察PBAF缺陷型细胞系在IFNγ处理下，相关基因的表达情况。ELISA分析PBAF缺陷型细胞系的趋化因子分泌水平；RT-PCR检测趋化因子的mRNA水平。流式细胞仪分析PBAF缺陷型细胞在应答IFNγ时的H2-Kb和PD-L1的表位水平。

结果：①RNA-seq转录组分析显示Arid2和Pbrm1缺陷的B16F10细胞具有相似的基因表达谱，与它们在PBAF复合物中的关键作用一致。Brd7突变体B16F10细胞的转录组更明显，表明Brd7还有具有不依赖PBAF的功能。与对照组B16F10肿瘤细胞相比，Arid2和Pbrm1突变细胞中许多代谢途径的mRNA一致地下调，特别是与mTORC1活性和胆固醇体内平衡相关的基因集。②RNA-seq和基因富集分析显示，与用IFNγ处理的B16F10细胞对照组相比，在Arid2和Pbrm1缺陷细胞中一致上调的基因中与IFNγ

和IFNα应答相关的基因集显著富集，表明Arid2和Pbrm1抑制IFNγ应答基因的表达。许多IFNγ应答基因被抑制与Arid2和Pbrm1是抗病毒免疫还是编码的趋化因子。③RT-PCR分析显示与对照组细胞相比，Pbrm1缺陷型细胞系中Cxcl9

的mRNA水平显著升高。④ELISA实验显示在IFNγ刺激后，与对照组B16F10细胞相比，Pbrm1缺陷型肿瘤细胞能充分地分泌更大量的Cxcl9和Cxcl10趋化因子。⑤流式细胞仪分析显示与对照组B16F10细胞相比，在一定浓度的IFNγ浓度下，Arid2缺陷型细胞具有显著增加的H2-Kb表位水平，但是，所有三种突变体都显示出应答IFNγ的PD-L1表位水平增加，这可能是由于部分复合物的活性仍然保留在敲除细胞系中。

这些数据表明，Arid2和Pbrm1减弱了B16F10肿瘤细胞对IFNγ的应答能力，而IFN是肿瘤细胞和T细胞间相互作用的细胞因子。因此，PBAF复合物通过调控应答IFNγ基因的表达和mTORC1通路调控肿瘤细胞对T细胞介导杀伤敏感。

（4）上文已经阐述了PBAF复合物调控应答IFNγ基因的表达而调节肿瘤细胞对细胞毒性T细胞介导的杀伤具有抗性，那么它是如何调控应答IFNγ基因的表达的呢？由于PBAF复合物属于染色质重塑复合物（主要调控染色质对转录因子的可接近性），那么它是否是通过调节IFNγ诱导基因的表达的染色质可接近性来调节转录因子的结合而影响转录的呢？

方法：使用ATAC-seq分析Pbrm1缺陷型细胞系在有和没有IFNγ处理的情况下的染色质可接近性并进行了motif和靶基因预测分析。

结果：在IFNγ处理后，Pbrm1缺陷细胞系与对照B16F10细胞相比大体上更多的基因组位点是可接近的。在Pbrm1缺陷型细胞系中IFNγ处理之前，648位点更容易接近，表明相应的基因准备应答IFNγ，2708个位点与对照组B16F10细胞相比，在Pbrm1突变体随着IFNγ暴露显示出增强的可接近性，但是它们在缺乏IFNγ的两种细胞系中的可接近性相似。motif和靶基因预测分析表明这些位点高度富集IRF

（干扰素调节因子）motif并与IFN调节基因相关。因此，Pbrm1的失活增强了染色质对许多IFNγ诱导基因的启动子/增强子的转录因子的可接近性。

结论：对细胞毒性T细胞介导的杀伤具有抗性受肿瘤细胞中许多基因和通路调控，相应的基因产物可以代表免疫疗法的靶标，因为失活突变使肿瘤细胞对T细胞介导的攻击敏感。PBAF功能缺失增加肿瘤细胞对γ-干扰素的敏感性，导致招募T细胞效应因子的趋化因子分泌增强。当Pbrm1失活时，抗肿瘤治疗对免疫疗法变得敏感。在许多人类肿瘤中，PBRM1和

ARID2的表达与T细胞细胞毒性作用基因的表达成负相关，鼠科黑色素瘤的Pbrm1缺失后被T细胞细胞毒性浸润更强烈。