科研汪的日常 38 再试一次

近来，细胞实验进行的不太顺利，原计划1周之内完成的实验，拖了一个月还没找到合适的解决方案，心态也从沮丧变为麻木。

刚接到任务的时候跃跃欲试，毕竟硕士三年做的就是围绕细胞进行的相关实验，小小的细胞转染可不是手到擒来。然而现实啪啪打脸，单就转染质粒的获得就让科研汪开启了新世界的大门。

从大佬那里拿到的质粒量比较少，需要通过转化、涂板、培养等步骤来扩增，然后通过质粒抽提来获得转染所用的质粒。

正常的质粒转化涂板之后会得到长得满满的菌落，而科研汪得到的肉眼可见的小菌落只有5个，挑选其中最大的两个菌落进行质粒抽提，意外只得到5μg的质粒，（平行进行的组别得到20μg，且质粒小提试剂盒按说明书来看，能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA，可直接用于DNA序列分析，各种酶促反应，PCR以及部分细胞系的转染等），好在测序的结果显示，虽然量少，但长出来的都是想要的目标质粒。

事情还没结束，这波质粒虽然序列是对的，但细胞转染的带光率很低（带荧光的都是转染上了目的质粒的细胞，平均每个视野里只有4-6颗带光的细胞）。于是乎第二波提质粒大戏上演，但同样的流程走下来，提出了50ng的东西（有可能是质粒浓度太低，也有可能测到的就不是目标质粒）。考虑大概率是菌体量太多，裂解不充分导致，因此第三次质粒抽提的时候将菌体分成两组，也稍稍增加了菌体裂解的时间，终于得到30+μg的质粒样品。

听上去简单的流程一波三折，接下来要换上新的试剂和细胞，再试一次！

参考链接：

1.质粒转化：

https://www.zhihu.com/question/509049594/answer/2291261676

2.质粒抽提:

https://baike.baidu.com/item/%E8%B4%A8%E7%B2%92%E6%8A%BD%E6%8F%90/6270362?fr=aladdin

3.质粒转染:

https://zhuanlan.zhihu.com/p/348712352