2021-06-15 当circRNA遇到Nanopore se

        由于大部分circRNA来源于基因的外显子，因此鉴定circRNA的关键在于确定back-splicing junction （BSJ）序列。但仅由BSJ又无法确认唯一的circRNA，因为存在单外显子circRNA和多外显子circRNA，相同的BSJ可能存在不同的外显子组成，这时候获取circRNA的全长序列才是确认circRNA的唯一方法。针对这样的问题，目前已有研究者开发出针对circRNA的三代测序技术。

circRNA Nanopore sequencing[1]

建库策略：使用RNase R进行 circRNA的富集，然后使用随机引物进行滚环逆转录，获得cDNA后，进行第二链合成，再进行Nanopore测序。

isoCirc[2]

建库策略：采取去rRNA和RNase R策略进行circRNA的富集，然后使用随机引物进行逆转录，逆转录过程中使用具有链置换活性的逆转录酶；再使用单链核酸酶将悬浮的单链DNA消化，保留与circRNA互补配对且等长的cDNA，然后使用连接酶将cDNA环化。采取滚环复制的发生扩增环状cDNA，再进行Nanopore 测序。

circRNA Nanopore sequencing[3]

建库策略：采用RPAD策略进行circRNA的富集，然后将circRNA进行片段化，再加上polyA尾，然后按照polyA+ RNA的方式构建Nanopore测序文库。

Reference

1. Zhang, J. et al. Comprehensive profiling of circular RNAs with nanopore sequencing and CIRI-long. Nature biotechnology (2021).

2. Xin, R. et al. isoCirc catalogs full-length circular RNA isoforms in human transcriptomes. Nature communications 12, 266 (2021).

3. Rahimi, K., Venø, M. T., Dupont, D. M. & Kjems, J. Nanopore sequencing of full-length circRNAs in human and mouse brains reveals circRNA-specific exon usage and intron retention. bioRxiv, 567164 (2019).