1. 建立项目团体
多机构合作，数据和利益共享。
2. 收集目标基因组信息
考虑的因素：
基因组大小、倍性、杂合性、GC含量和重复。
数据库查询：
fungi (http://www.zbi.ee/fungalgenomesize)
animals (http://www.genomesize.com)
plants (http://data.kew.org/cvalues)
估计：
流式细胞仪和kmer频率分布（建议两种都用）。
3. 设计最佳实验流程
高质量染色体水平的参考基因组是关键。
质控：reads长度、错误率、深度、覆盖度、文库等。
有钱：PacBio/ONT + Hi-C
没钱：Illumina/10X GC(genomics chrominum) + Hi-C
从头组装：一般是完全denovo。
参考基因组辅助：利用近缘物种作为参考和指导进行组装，该方法对数据和计算量较小，但是现有参考基因组可能有错误和重排。
目的：构建一致的单倍型或定相单倍型的染色体水平组装。一般的组装是将2条序列整合为1个单倍型，因此不能得到二倍体信息。
选择合适的工具和流程：考虑组装的质量和连续性，包括速度和敏感性。
三代组装工具网站：
LRS-DB https://long-read-tools.org/
常用的组装工具软件：
image.png
4. 选择最佳测序平台和准备文库
文库制备的两个考虑：目标基因组大小、测序样本数。
reads： 短(Illumina, 454, SOLiD, MGI, Ion Torrent)，长(ONT and PacBio)或混合(hybrid) read
5. 选择最佳DNA来源和提取方法
不含杂质。
最低量要求：
Illumina 和 10xGC > 3 ng, PacBio > 20 μg, ONT > 1 μg, BioNano > 200 ng, Dovetail > 5 μg 。
三代平均DNA长度>25 kb。
使用核与细胞器DNA比率更高的组织。
纯化DNA的测量/定量可使用分光光度法和基于荧光的方法。
6. 检查计算资源与要求
数据量、基因组大小、杂合率和倍性等对内存
需求、CPU数量和计算成本成几何增加。
可选择云计算合理分配。
7. 选择最佳计算设计和流程
三种选择：
（1）最大化内部员工或协作
（2）从服务外包提供者
（3）模拟具有不同设置的数据
8. 基因组组装
推荐的基因组组装和注释流程图：
image.png
强烈建议使用BioNano和Hi-C数据来达到染色体级组装，因为这两种方法可通过验证初始组装的完整性，纠正方向错误，排序scaffolds来完善结果。
9. 在注释前检查组装质量
在鸟枪法时代，denovo依赖于于算法和试验设计。reads长度、文库大小、reads准确性和基因组复杂性等决定了组装的准确性和连续性。
质量评估：
- 组装大小
- 组装连续性（N50，NG50，NA50，NGA50）
- 重叠群contig数目和（平均）长度
- 组装可能性得分（通过reads比对每一个候选组装来计算）
- 组装完整度（BUSCO得分或RNAseq mapping）
- 其他：QTL、ESTs、荧光原位杂交、BAC克隆、染色体水平遗传图谱。
三个最重要的指标：连续性、准确性、完整性。
方法：三代/10XGC，BioNano，Hi-C数据；软件LR_Gapcloser。
10. 基因组注释
注释内容：
- 识别非编码区：重复序列、转座子。
- 识别编码区（称为基因预测）：内含子、外显子、CDS、5/3 UTR。
- 附加这些元素的生物学信息。
注释的方法：
- 手动注释：耗时昂贵，需要获得准确的基因模型和基因集。
- 自动注释：置信度和可靠性低（通常基于直系同源物种，不同数据库数据不同）。
- 半自动注释：集成不同的结果获得一致的注释，平衡了手动和自动方法。
结合比对EST、RNAseq、蛋白序列作为外部基因组组装证据。
结合方法和结果（尤其是MAKER，BRAKER和String-Tie）可以有效地提高注释预测的数量和准确性（尤其是对孤儿基因和其他年轻基因）。
功能注释GO等。
在线基因组注释工具：
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命令行注释工具：
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非编码RNA注释：
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重复序列注释：
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11. 建立一种可查询和可共享的输出格式
公共数据库 or 自建数据库？
12. 分发社区来优化组装和注释
不同版本软件结果不同，为确保稳定，数据可重复，需持续维护和更新。
植物社区示例：
https://nbenth.com/annotator/index,
https://solgenomics.net
https://www.helmholtz-muenchen.de/pgsb
动物社区示例：
http://www.slimsuite.unsw.edu.au/servers/apollo.php
https://bovinegenome.elsiklab.missouri.edu
http://www.gmgi.org/genomics-fish-shellfish
https://www.sanger.ac.uk/science/data/vertebrate-genomes-sequencing
对于初学者的基因组组装和注释流程的建议
不建议纯二代组装。
纯三代或混合组装方法：
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此文太多废话，慎读~~~
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