这是RNA-seq上游分析的最后一站，seq数据定量。这一篇文章会介绍基于k-mer定量两软件：kallisto和salmon。其中关于kallisto的部分我会附上TBtools插件的用法。
抱歉又更新晚了，之前一直想尝试selected alignment method来定量RNA-seq数据。电脑不给力，试了好几次都失败了，只好放弃……

1. 什么是k-mer

简单来说，k-mer是一段长度为k的序列，而后面的mer即为monomeric unit（单体单元），也就是每个碱基。因k-mer包含k个碱基，若一段核酸序列长度为L，以一个碱基为步长滑动，那么根据这个核酸序列就可以得到L-k+1个k-mer；由于每个位点的碱基可以为（A、T、C、G）中的任意一个，因此k-mer理论上说有个不同的序列。原本一条长片段，就变成了很多短的片段，因此计算机处理的碱基数量也会增加很多倍。而且，每次取k-mer是同一条reads正反取两次，这就是对这条reads的反向互补序列再取一次k-mer。下面的图就形象化了这一过程，长度为15的序列，选取k-mer为5，那么就会得到11（15-5+1=11）个5-mer。

如果你有兴趣，可以跳转进一步了解。
https://cloud.tencent.com/developer/article/1613847

2 利用kallisto定量

安装kallisto还是很轻松

conda install kallisto

定量需要两步，第一步是对你的数据建立index。之后就能用建立好的index做RNA-seq数据定量。
建立目录的命令很简单：

kallisto index -i kallisto_IWGSC transcripts.fasta

由于可变剪切等原因，同一个mRNA可能有不止一个isoform，如果你只在乎某个基因转录了多少，不在乎有多少同一个mRNA有多少个isoform的话，那么可以用TBtools提取每个mRNA的最独特的序列。一般来讲提取的是所有isoform中最长的那个序列。听起来很合理，但有些时候会出问题，比如那个最长序列本身不太对的时候。

定量之后只需要一个for语句循环就能完成RNA-seq的定量

#kallisto定量分析
for i in `seq 56 79`;
do
mkdir quants/SRR51316${i};
kallisto quant -i '/mnt/d/onecloud/OneDrive/wheat geno/wheat_index/kallisto_IWGSC' --single -o quants/SRR51316${i} -l 200 -s 30 SRR51316${i}.fastq.gz;
done

salmon定量分析

salmon的逻辑跟kallisto是一样的，都是先建立index再定量。
跟kallisto不同得地方是，salmon支持更多种的index模式
小麦因为基因组太大了，试了好几次建库都不完整，索性只说最简单的，既基于转录组数据建立index。如果你目标基因组比较小（如水稻，拟南芥），推荐你们尝试一下selective alignment。
地址为：
https://combine-lab.github.io/alevin-tutorial/2019/selective-alignment/
废话不多说，salmon的建立index得命令差不太多。就是把index和输出参数换了个位置
具体命令：

$ salmon index -t transcripts.fasta -i IWGSC_1.1

其中
-t 是转录组数据文件
-i 是输出地址
之后再进行定量就好

for i in `seq 56 79`;
do
mkdir quants/SRR51316${i};
salmon quant -i IWGSC_1.1 -l A \
-r /SRR51316${i}.fastq_clean.fq \
-p 8 --validateMappings --gcBias -o quants/SRR51316${i};
done

如果是双端测序数据

salmon quant -i index -l A\
-1 read1.fastq.gz -2 read2.fastq.gz \
-p 8 --validateMappings -o read_quants

其中
-i 对应的是index地址
-1和-2对应双端测序两个fastq文件
-p 是设定核心数量
-o 是输出地址

TBtools的众筹插件

这部分可能是最没必要讲的了。

都是最简单的东西了，需要注意的是，TBtools插件每次定量前都默认会重新建立一次index，所以……数据多的时候耗时会比较久……
不过这个插件最后会自动统计并整理好gene counts和TPM文件，方便后续DEseq2的操作。

最后alignment-free到底准不准

首先老版本好像有问题，新版本修复了。具体参考马省伟大佬的文章。
http://blog.sciencenet.cn/blog-1094241-1133526.html
其次，好像是不是alignment-free最终准确率都差不多。但是基于k-mer明显快很多，而且普通pc就能跑……具体参考发表在NC上的文章
https://www.nature.com/articles/s41467-017-00050-4

抱歉鸽了这么久……也不知道为啥会鸽……