10x Chromium 平台的核心 -- Next GEM 技术
Next GEM 技术
Next GEM 技术的核心 -- 凝胶微珠
凝胶微珠（Gel Beads）表面上百万的寡核苷酸引物序列是多种建库策略得以高效实现的关键
3' v2 Libraries
3' v2 library是在mRNA 3' 端捕获并扩增，凝胶微珠上的 Oligo Primer 由22nt Illumina扩增引物Read1，16nt 10x Barcode，10nt Unique Molecular Identifier (UMI) 和30nt Poly(dT)VN构成。
对于10x Barcode，每个微珠上的序列相同，不同微珠上的序列不同，用以区分文库的细胞来源。而对于UMI，每个微珠上的序列各异，捕获的mRNA经反转录得到的cDNA有不同的UMI标签，后经扩增，测序，再数据分析时，可有效避免PCR bias。Poly(dT)反转录引物对3' 端为Poly(A)的mRNA进行捕获，在反转录酶的作用下，反转录生成cDNA。
使用的反转录酶会在反转录到达mRNA 5'末端时，在cDNA 3' 末端添加不依赖模板的多个C碱基，template switching oligo（TSO）的3' 端有三个非脱氧的G碱基，可与cDNA 3' 端杂交互补，在反转录酶作用下，cDNA继续延长，终止后用于下游扩增。
GEMs随之破裂，收集cDNA分子，进行PCR扩增。cDNA扩增后，进行酶切片段化，筛选尺寸合适的插入片段，通过末端修复，加A尾，接头连接Read2测序引物。再经过PCR连接上Illumina P5、P7接头和Sample index。文库构建完成。最终得到的3' 基因表达文库结构如下图红框所示。
V(D)J Libraries
V(D)J library是在mRNA 5' 端捕获并扩增，凝胶微珠上的 Oligo Primer 与3' v2 library相比，没有了30nt Poly(dT)VN，取而代之的是13 nt Switch Oligo。
游离的Poly(dT)引物与mRNA 3'端的Poly(A)互补，引起逆转录反应，与3' v2 library相同，使用的反转录酶会在反转录到达mRNA 5'末端时，在cDNA 3' 末端添加不依赖模板的多个C碱基，进而与凝胶微珠上的TSO末端的rGrGrG互补杂交，在反转录酶作用下，cDNA继续延长，终止后用于下游扩增。
之后可作类似3' v2 library的多轮PCR，构建得到5' 基因表达文库，如下图红框所示。
而同步可进行的，是V(D)J enriched 文库的构建。其中TCR或者BCR的V(D)J序列通过设计在C区域的巢式PCR引物进行富集，之后仍然是片段化，加A尾，接头连接Read2测序引物等等步骤，最终V(D)J enriched 文库文库结构如下图红框所示。
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