fast_qc对测序数据的质控

fast_qc是一款用于测序数据质量分析的java软件，它的使用非常简单，这篇文章只简单记录fast_qc的使用方法，以及如何读懂fast_qc的图形化报告。

fastqc [-o output dir] [--(no)extract] [-f fastq|bam|sam] [-c contaminant file] seqfile1...seqfileN
-o --outdir  #fast_qc生成的报告文件的储存路径
--extract  #fast_qc在运行时默认会将生成的所有文件打包到1个压缩文件里（使用该参数便不再打包）
-t --threads #选择程序运行的线程数（每个线程占用250M内存）
-f  #强制指定输入文件格式（可以是fastq or bam or sam）
-c --contaminants #污染物选项，输入为文件（文件格式"Name\tSequences"，fastqc计算时会评估污染的情况并统计分析）
-a --adapter #接头选项，输入为文件（文件格式"Name\tSequences"，储存adapter序列信息，如果没有使用该选项，fastqc会默认使用通用引物序列评估adapter污染）

1. Basic statistics

有效信息：

• 总序列数量
• 被标记为低质量序列的数目
• 测序长度

• GC含量

  
  base statistics

2. Per base sequence quality

这张图可以清晰得展示测序数据的质量值分布：
涉及fastq文件中“碱基质量值Q”的理解（参考：https://www.jianshu.com/p/39115d21ee17）

图中各项元素的统计学意义：

• 横轴：测序序列的第1个-第150个碱基（图中只取到99）
• 纵轴：碱基质量值Q（Q越大，质量越好）
• 每1个boxplot都是该位置所有序列的碱基Q值的统计：
  上面的bar是90%分位数；
  箱子的上边是75%分位数；
  箱子中的横线是50%分位数；
  箱子的下边是25%分位数；
  下面的bar是10%分位数
• 蓝色的细线是各个位置的平均值的连线

我们通常取用Q>20的碱基用于后续分析，图中可以看到90bp之后，碱基质量值Q的10%分位数便始终低于20，因此可以把90bp之后的序列切除。

per base sequence quality

3. Per sequence quality scores

• 横轴：平均测序质量值（Q）
• 纵轴：reads的数目

该图绝大多数reads的平均测序质量Q值在35以上

per sequence quality scores

4. per tile sequence quality

分析flowcell上不同的物理位置的测序质量分布情况，观察是否存在系统误差（fastq文件的第一行通常记录有tile编号）

• 横轴：测序序列的第1个-第150个碱基
• 纵轴：flowcell上tile的编号
• 蓝色代表质量分数较好，绿色代表质量分数差

图中可以看到，刚开始测序时每个tile的测序质量都很好，随着读长的增加，一些个别的tile（如1201）很早便出现测序质量降低的情况

per tile sequence quality

5. Per base sequence content

• 横轴：测序序列的第1个-第150个碱基
• 纵轴：AGCT碱基在每个位置上的百分含量

理论上讲，A与T相等，C与G相等，但是测序刚刚开始时由于仪器不稳定，很可能出现图中所示的情况。因此，即使测序质量很高，也需要切掉开始的部分序列信息。

Per base sequence content

6. Per sequence GC content

• 横轴：平均GC含量百分比
• 纵轴：序列数量
• 蓝色的线：是程序根据经验分布给出的理论值
• 红色的线：测序数据的真实GC含量分布

因为不同物种的核酸中，GC含量不同，因此如果红色的线出现双峰，很有可能数据中混入其他物种的DNA序列

Per sequence GC content

7.Sequence Length Distribution

• 横轴：测序长度（单位为bp）
• 纵轴：测序序列的数目

理论上讲，测序仪读出的reads长度应该是完全相等的，但是总有一些偏差。不过偏差通常都在1bp之内，不会影响后续分析。如果偏差较大，则说明仪器在此次run中存在问题。

Sequence Length Distribution

8. Adapter content

• 横轴：测序序列的第1个-第150个碱基
• 纵轴：adapter碱基的含量

这张图中，最后30多bp碱基中存在一定比例的adapter序列，通常是由于建库过程中，部分插入片段过短造成的 （低于读长150bp）。
这种情况，需要在后续分析的时候需要先使用cutadapt软件进行去接头

Adapter content

9.Sequence Duplication Levels

• 横轴：重复次数
• 纵轴：百分比
• 蓝色线：描述总测序序列的重复率
• 红色线：描述重复序列的重复率

从图中的蓝线可以看出，60%的测序序列是uniq序列（只有一条），20%的测序序列存在2条相同的序列，10%左右的测序序列存在3条相同的序列；从红线可以看出，80%的重复序列重复出现2次，15%的重复序列出现3次，3%的重复序列出现4次

Sequence Duplication Levels

实验层面如何减少duplication?

• 提高原始DNA含量（减少多次PCR产生的PCR bias）
• 建库时DNA片段长度尽可能均一

分析层面如何减少duplication?

• GATK/Picard: MarkDuplicates
• Samtools: rmdup
• Opengen: gencore