大脑内有成千上万条的神经环路，是大脑处理复杂感知信息并产生相应行为的基础。剖析哺乳动物脑中细胞特异性的神经环路是神经科学的一项重要研究内容。2022年5月6日，加州大学旧金山分校研究者在Nature Neuroscience杂志（IF=24.884）上发表了文章“Trans-Seq maps a selective mammalian retinotectal synapse instructed by Nephronectin”，历时五年时间开发了一套新型的基于跨突触连接性的单细胞测序技术。基于这一技术，回答了几个问题：（1）眼睛里面的神经细胞是如何识别它在大脑里面的对应突触后细胞，进而形成巨大神经网络的；（2）形成这些一一对应的特异突触的分子机制是什么。

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研究摘要

小鼠的视觉系统可以作为模型来研究哺乳动物的回路，尽管现有研究已经累积了丰富的视网膜回路相关知识，但从不同的视网膜神经节细胞（RGC）类型到不同的大脑神经元类型的远程连接图仍然是未知的。本研究开发了一种综合方法，称为Trans-Seq，可用于绘制RGC到上丘脑（SC）回路。Trans-Seq结合了荧光前向跨突触示踪剂，包括编码优化的小麦胚芽凝集素与mCherry融合，以及单细胞RNA测序。用Trans-Seq对由遗传定义的RGC类型支配的SC神经元类型进行分类，并预测了从αRGC到Nephronectin阳性宽场神经元（NPWF）的神经元配对。用基因标记、电生理学和逆行追踪来验证这种联系。然后，利用Trans-Seq的转录组数据确定了Nephronectin是通过与Integrin α8β1结合，从αRGC到NPWF选择性突触选择的决定因素。Trans-Seq方法可广泛用于从基因定义的突触前神经元发现突触后回路。

研究背景

视网膜中各种神经节细胞的形态学、功能学和转录组学的研究相对透彻，而且视网膜内的神经环路研究相对成熟。但从视网膜到脑内视觉相关脑区的长距离投射的研究很少。视网膜神经节细胞是如何和脑内的神经元连接的，这些特异的突触是如何形成的，这一连接又传递了哪些独特的视觉信息，至今都是未解之谜。

这是因为要实现具有细胞类型分辨率的神经环路在体长程示踪，还有一系列严苛的技术瓶颈需要突破。现有的顺行跨单突触技术仍有许多难以克服的缺点，比如病毒毒性较大导致难以进行电生理记录，或是无法兼容细胞特异性的遗传学标记。因此一种能够低毒、单一成分、跨单突触、可实现在体荧光成像的示踪剂期待出现。本研究发明了一种名为Trans-Seq的技术平台，成功克服了长程环路示踪过程中所遇到的诸多技术难点，而且实现了除视觉系统外、多个脑区细胞类型水平连接组学的研究。基于这些技术突破，本研究更深入地研究了一条从视网膜到上丘细胞特异性的神经环路，并揭示了指导这条环路形成的新的分子机制。

主要结果

Trans-Seq结合了两种技术：顺行神经环路示踪技术和高通量单细胞测序技术。首先利用基因工程改造麦胚凝集素（Wheat Germ Agglutinin, WGA）并筛选到一个特定的融合蛋白产物mWGA-mCherry (mWmC)，并通过腺相关病毒载体（AAV）感染特定靶点细胞类型后，可实现顺行单突触的示踪。而后，通过单细胞RNA-Seq技术，分析被跨突触荧光标记的突触后神经元的细胞亚型，从而实现连接组学和转录组学的结合。

图1 Trans-Seq长程跨突触环路示踪的工作流程示意图

首先将Trans-Seq技术运用于小鼠的视网膜—上丘的环路中，在被红色荧光标记的视网膜神经节细胞下游细胞的单细胞测序中，将上丘中接受视网膜投射的细胞分成了三类兴奋性神经元，五类抑制性神经元。这一结合了连接组学和转录组学的结果，不仅找到了三类接受视网膜投射神经元的新的分子标志物，还揭示了从视网膜中的节细胞（RGC）到上丘神经元亚型的特异突触连接图谱。通过生物信息学的预测，还找到一条从视网膜阿尔法型节细胞（αRGC）到上丘Nephronectin阳性广树突神经元（NPWF）的突触连接，这一结果还得到了伪狂犬病毒示踪和光遗传辅助电生理等实验的平行验证。

为了进一步揭示这一神经连接网络的分子形成机制，本研究通过对Trans-Seq产生的单细胞转录组数据库的深度分析，还发现了一种细胞外基质蛋白Nephronectin，它是从αRGC到NPWF神经元突触识别所必需的特异分子。Nephronectin是目前被报道的第一个被找到的控制哺乳动物从视网膜到大脑的突触连接特异性的分子。本研究还发现突触前的Integrin α8β1和Nephronectin相互作用。进一步的分子、遗传和电生理实验证明了αRGC中的Integrin α8β1和NPWF神经元中的Nephronectin在指引轴突选择分层，形成特定突触的过程中发挥重要的作用。这一发现将为相关的眼科和神经系统疾病的诊疗带来启示。

图2 Trans-Seq发现了视网膜αRGC和上丘NPWF神经元间的特异连接，并揭示了Nephronectin是决定这一连接形成的分子

研究结论

总之，Trans-Seq为哺乳动物系统中基于基因的回路研究开辟了一条新的技术途径。它直接将神经元分类和功能连接测试结合起来，通过识别特定的神经元对来促进发现，这些神经元对可以通过电生理学进一步验证。通过这种将神经元转录组转化为数字连接体并识别连接的方法，Trans-Seq平台代表了一种可推广的顺行追踪和测序方法。此外，利用Trans-Seq单细胞转录组数据，本研究鉴定了一种ECM分子，肾连素，在体内选择性视网膜顶叶层下选择所需的分子。

参考文献

Tsai N Y, Wang F, Toma K, et al. Trans-Seq maps a selective mammalian retinotectal synapse instructed by Nephronectin[J].Nature Neuroscience, 2022, 25(5): 659-674.

李超  | 文案