【前沿背景】
在临床上，由于存在引起慢性炎性疾病的复杂的微生物群落，口腔细菌感染的治疗具有挑战性。在儿童，青年和成人受试者中引起严重健康问题的两种最常见病理是龋齿和牙周炎。重要的是，这两种情况均具有“牙斑菌”，这是一种牢固附着在口腔表面的微生物生物膜，是主要的病因。龋齿是一种高度流行的疾病，其定义为硬质牙齿组织脱矿质会触发空化作用并暴露牙本质和牙髓组织。如果得不到适当的治疗，龋齿可能会导致不可逆的牙髓病理（即牙髓坏死），以及后来的根尖牙周炎-根尖周组织的炎症过程，包括但不限于骨骼。同样，牙周炎会在细菌遇到影响软，硬组织的牙龈沟时发生，如果处理不当，组织损伤会导致牙齿脱落。口腔细菌感染管理的主要目的是消除生物膜及其副产物。当前用于牙周和牙髓感染的治疗依赖于牙齿表面和/或牙根管系统的生物力学清洁，随后通常使用冲洗剂和/或抗生素混合物。上述消毒方法存在许多缺点，包括但不限于生物相容性问题，这是由于选择不加的使用的毒性所致。因此，必须有一个安全的药物输送系统来消灭感染，阻碍疾病的进展并适当地对患处做好可靠，持久的恢复和/或再生治疗的准备。
【科研摘要】
口腔细菌感染是导致牙齿和锚固牙齿的牙周结构逐渐破坏的主要原因。最近，可注射的水凝胶引起了越来越多的关注，其作为一种有针对性的微创平台，可用于个性化治疗的局部递送。美国密歇根大学牙医学院Marco C. Bottino 和Zeynep Aytac教授团队在8月高分子顶级期刊《Biomacromolecules》发表了题为‘‘Hybrid Antimicrobial Hydrogel as Injectable Therapeutics for Oral Infection Ablation’’一文。
他们开发论述了可注射和可光交联的明胶甲基丙烯酰基（GelMA）水凝胶，成功地与环丙沙星（CIP）洗提的短纳米纤维一起工程化，用于口腔感染消融。为此，已将CIP或其β-环糊精（β-CD）-包合物（CIP/β-CD-IC）掺入到聚合物电纺纤维中，然后将其切成短的纳米纤维，然后包埋在GelMA中以获得可注射的混合抗菌水凝胶。由于通过β-CD-IC增强了CIP的溶解度以及GelMA的可调节降解特性，水凝胶可促进局部持续且有效的细胞友好型抗生素剂量，这是通过一系列证明减少细菌毒性的细菌测定法测得的革兰氏阳性肠球菌的生长。总的来说，可预见到这种创新的混合水凝胶作为可注射平台技术的巨大潜力，该技术可广泛应用于口腔感染消融，例如牙周疾病和牙髓病理。
【图文解析】
1. 材料的合成
使用共沉淀法以1：1的摩尔比合成CIP和β-CD的包合物（IC）/β-CD-IC（图1a）。首先，将β-CD溶解 在水溶液中加入CIP，然后在室温（RT）下搅拌12小时。随后，在过滤之前将溶液在4℃下保持5h，以获得CIP/β-CD-IC粉末。之后，将粉末在通风橱中干燥12小时，并进一步用玛瑙研钵和研杵研磨成细粉。
聚二恶烷酮纤维（PDS-F），CIP负载的PDS纳米纤维（PDS-CIP-NF）和CIP/β-CD-IC负载的PDS纳米纤维（PDS-CIP/β-CD-IC-NF）均通过 使用定制设备进行静电纺丝。PDS-CIP-NF和PDS-CIP/β-CD-IC-NF通过添加10％CIP（相对于聚合物为w/w）和含10％CIP（w/w）的CIP /β-CD-IC制备在室温下，分别将其相对于聚合物的10％（w/v）的PDS溶液溶于2 mL HFIP。通过在RT过夜使用溶于HFIP的10％PDS（w/v）制备无毒PDS-F。
图1.（a）使用静电纺丝合成CIP/β-CD-IC和生产纳米纤维的示意图；（b）将纳米纤维垫切割成短纳米纤维，并与GelMA混合以制备载有短纤维的可注射水凝胶纳米纤维。
3.3 明胶甲基丙烯酰基的合成与表征
使用1 H NMR光谱定量明胶甲基丙烯酸。图4a中的光谱证实在5.3和5.6 ppm处引入了丙烯酰胺双键，这是GelMA光聚合所必需的。1.5至2 ppm之间的峰是由于甲基丙烯酸酯的甲基官能团所致，证实了明胶甲基丙烯酸的成功合成。3 ppm处的峰是由于明胶中的赖氨酸亚甲基。GelMA的甲基丙烯酸化程度在治疗性分子的扩散中起重要作用。因此，它是通过丙烯酸甲酯和甲基峰与碳水化合物质子峰的相对积分来计算的（δ= 3.7–4.2）。数据表明，本文合成的GelMA具有中等（〜56％）的甲基丙烯酸化度。
图4.（a）GelMA的1H NMR谱图显示了掺入明胶中的5.3至5.6 ppm和1.5至2 ppm的甲基丙烯酰基之间的目标区域。3 ppm处的信号归因于明胶中的赖氨酸亚甲基。1 H NMR：质子核磁共振。GelMA：明胶甲基丙烯酰基。（b）挤出后水凝胶的可注射性测试连续性的代表性宏观图像。重要的是要注意嵌入的短纳米纤维在水凝胶中的相当均匀的分布。（c）负载CIP和CIP/β-CD-IC的GelMA水凝胶和GelMA的酶促降解。统计分析表明，对于2.5％的装有CIP和CIP/β-CD-IC的GelMA和GelMA，其降解速度明显快于10％的GelMA组。（d）在7天内CIP从GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF（2.5％和10％）和GelMA-PDS-CIP-SF（2.5％和10％）的释放曲线。
3.4 水凝胶的可注射性
全身性给药通常会导致病原细菌产生抗生素抗药性，并增加重复感染的风险。基于水凝胶的药物输送系统代表了另一种策略，可在提供局部治疗益处的同时预防细菌耐药性问题。值得注意的是，可注射水凝胶还具有克服与通常用于植入预成形水凝胶的侵入性外科手术方案相关的问题的益处，该问题可能导致患者的疼痛，不适，较高的成本和时间。现在通常理解，低于15％的GelMA浓度产生可预测的降解速率和生物相容性。除此之外，浓度还影响药物扩散。因此，降低GelMA浓度可导致更快的释放速度。数据表明，可以使用胰岛素（31G）针成功注射2.5％和10％的GelMA-PDS-CIP-SF和GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF（图4b）。随着GelMA的浓度从2.5％增加到10％，可注射性仅略有下降。挤出后没有看到明显的对接或间断，因为粘度足够低，水凝胶无法穿过针头，因此证明了其在微创牙科应用中的前景，例如可以填充不规则形状的牙周缺损或有效地穿透复杂的牙根根管解剖。在这里，作者使用了一种光引发剂（LAP），这种光引发剂通常在牙科固化设备中可见。实际上，以前已经证明15％的GelMA可以成功地注入根管并原位光交联。重要的是，取决于根管或骨缺损的深度和/或总体积，可以以逐层递增的方式注入和水交联配制的水凝胶，以确保均匀的交联并因此确保其整体性能。
3.5 水凝胶的酶促降解
水凝胶降解在治疗药物的控制释放，防止药物快速清除和引起长期的生物学反应中起重要作用。因此，进行了配制的基于GelMA的水凝胶的胶原酶消化，以了解它们在体内可能的降解情况。如图4c所示，2.5％的GelMA-PDS-CIP-SF和2.5％的GelMA-PDS-CIP /β-CD-IC-SF均在24小时内降解，而10％的GelMA-PDS-CIP-SF和10％ 168小时后，GelMA-PDS-CIP /β-CD-IC-SF降解。两者合计，体外降解测定的结果表明配制水凝胶平台的两个主要方面。首先，完全降解的时间在10％的GelMA中比在2.5％的对应物中更长。其次，可能由于与水凝胶相的相互作用，短纳米纤维的存在稍微减缓了降解。尽管由于天然微环境的复杂性，体外胶原酶的水平不能直接转化为特定的体内或临床反应，但正如先前报道的那样，体内应发生相似的降解速率。在该研究中，已表明，将载有洗必泰（CHX）的硅铝酸盐纳米管（Halloysite）掺入GelMA导致了可生物降解的水凝胶制剂，该制剂具有显着的抑制细菌生长的能力，同时引起最小的局部炎症反应。值得注意的是，尽管埃洛石被认为是GRAS（通常被认为是安全的化合物），但这些生物相容性纳米管不可生物降解。为了加快临床翻译速度，假设完善的抗生素洗脱生物可降解聚合物纤维和水凝胶形成混合注射治疗剂之间的关联可能对细菌感染的管理具有积极意义，而同时又是完全可生物降解的。
3.6 药物释放
CIP是一种广泛用于口腔感染管理的疏水性药物，但是其水溶性差会导致目标部位的生物利用度不足。重要的是，先前的研究表明，由于药物溶解度的提高，CIP释放可通过复合作用得到改善。此处合成了CIP的β-CD-IC，并将其掺入纳米纤维中以提高生物利用度。CIP从GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF和GelMA-PDS-CIP-SF在7天内的药物释放曲线如图4d所示。与GelMA-PDS-CIP-SF中的相比，GelMA-PDS-CIP /β-CD-IC-SF中的CIP释放明显更高。此外，正如预期的那样，与10％的GelMA对应物相比，低浓度的GelMA（即2.5％的GelMA-PDS-CIP /β-CD-IC-SF）的CIP释放略高。在这里，确定了两个关键的药物释放调节贡献者：即通过β-CD-IC进行CIP官能化和可调递送载体，一种建立的光交联水凝胶（GelMA），其中控释是其固有特征。详细地说，即使两种水凝胶制剂都装有10％CIP（相对于PDS），与GelMA-PDS-CIP-SF相比，GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF释放的CIP量也更多。这与通过在PDS-CIP/β-CD-IC短纳米纤维中形成环糊精/包裹体复合物（CD-IC）所提供的CIP的水溶性和生物利用度提高有关。其次，CIP释放在2.5％GelMA-PDS-CIP /β-CD-IC-SF中比在10％GelMA对应物中更为明显。如在酶促降解试验中所见，这归因于2.5％GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF的总体降解速度更快（图4c）。值得注意的是，2.5％的GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF在24小时内完全降解，而其10％的GelMA对应物则需要168小时才能完全降解。值得一提的是，尽管有CIP修饰的水凝胶（GelMA-PDS-CIP-SF）是游离的（即没有β-CD-IC），但与CIP/β-CD-IC（GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF）在酶促降解方面，10％的GelMA-PDS-CIP-SF释放的CIP量略高于2.5％的GelMA-PDS-CIP-SF。造成这种差异的一个可能原因可能是与游离CIP和GelMA之间的相互作用相比，CIP/β-CD-IC与GelMA之间形成了更强的相互作用。总而言之，数据证实CIP/β-CD-IC能够增加系统的溶解度，与非功能化药物相比，从一开始就释放出更多的药物。
3.8 抗菌功效
如前所述，该策略着重于通过在β-CD系统中形成包合物来提高药物溶解度，从而扩大其抗菌潜力。还值得注意的是，由于短纳米纤维与纳米纤维相比具有更大的表面积，因此使用PDS-CIP/β-CD-IC-SF形式的短纳米纤维可增强CD-IC的效果。以类似垫子的方式可以通过比较SF和NFs的琼脂扩散数据来确认这一结果（表1）。但是，这些差异不如样品中CD-IC的效果高。
表1.电纺纳米纤维（NF）和短纳米纤维（SFs）的琼脂扩散数据
粪肠球菌的生长抑制（平均值±标准偏差，单位为mm）。不同的大写字母表示同一列的统计差异显着（p<0.05）。不同的小写字母表示该时间段内的统计显着性（p <0.05）。< span="">
3.8.1 琼脂扩散
根尖周感染以及牙髓治疗失败的主要原因是存在以浮游细胞或生物膜形式存在的微生物。值得注意的是，粪肠球菌在原发性和继发性牙髓感染中被称为关键病原体。为了确定电纺垫，短纳米纤维和用短纳米纤维改性的配制的混合GelMA水凝胶的抗微生物作用，在粪便中进行了直接和间接接触的琼脂扩散试验（即从14天后收集的洗脱液）样品在PBS中孵育）。
表1列出了PDS-CIP-NF，PDS-CIP /β-CD-IC-NF，PDS-CIP-SF和PDS-CIP /β-CD-IC-SF组的抗菌数据。值得注意的是，0.12％CHX溶液用作阳性对照。总体而言，所有含CIP的聚合物纤维在直接样品/细菌草坪接触和洗脱液/细菌草坪相互作用中均表现出对粪肠球菌的显着抑制作用（表1）。重要的是，粪肠球菌对PDS-CIP/β-CD-IC-NF和PDS-CIP/β-CD-IC-SF的抑制区更为显着，表明由于较高的抑菌效力，其抑菌效力显着（p<0.05）与pds-cip-nf和pds-cip-sf相比，药物溶解度更高（图6a，b）。此外，与nf组相比，用sf洗脱液处理的粪肠球菌草坪具有更高的抗菌效果，这可能是由于前者的表面积较大（表1）。< span="">
图6.实验组针对粪肠球菌的琼脂扩散测定；0.12％CHX和PBS分别用作阳性和阴性对照。（a-b）代表性图像显示了静电纺丝纳米纤维（NF）垫和制备的短纳米纤维（SFs）的细菌生长抑制作用。（c-d）代表性图像显示了混合短纳米纤维修饰的GelMA水凝胶的细菌生长抑制作用。
3.8.2 生物膜模型
生物膜是高度组织化的，由微生物形成的复杂实体，其特征与浮游悬浮液中的微生物本质上不同。众所周知，当细菌为微生物生物膜形式时，由于细胞外聚合物提供的内在保护，它们对抗生素具有高度抗性。为了进一步解决建议的完全可生物降解的基于混合抗微生物剂GelMA的水凝胶作为口腔感染消融的可行注射治疗剂的临床相关性，作者还评估了对感染的牙本质（粪肠球菌）生物膜模型的抗微生物功效（图7a，b）。治疗1周后，通过菌落形成单位形成测定法确定抗菌功效。与未处理组（即细菌对照组）和所有其他实验组相比，GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF组的2.5％显着降低了活细菌数（p<0.05）。在其他实验组中，尽管细菌数量在统计学上相似，但与细菌对照组相比，所有含CIP的水凝胶均导致细菌活力的显着降低（图7a）。最终的临床目标是彻底根除在牙齿，根管系统或根尖周病变中定殖并阻止再次感染的微生物及其副产物。根据定量数据（图7a），SEM成像结果表明，与细菌对照组相比，所有实验组的细菌细胞/生物膜都少得多（图7b-g）。与2.5％和10％GelMA制剂的CIP相比，CIP /β-CD-IC组显示出最高的生物膜破坏力。这些结果与以前的研究一致，后者使用IC来改善化合物在水性环境中的溶解度并提高其抗菌活性。最后，尽管人们普遍担心与CIP剂量相关的潜在细胞毒性，但随着时间的流逝，CIP的低但仍具有细胞相容性的受控释放肯定支持未来使用临床相关方案（例如根尖周感染）进行体内研究以确定全部临床潜力工程水凝胶。总体而言，考虑到不同的药物释放速率和水凝胶降解，所提出的基于GelMA的可注射平台在局部递送治疗药物以消除口腔细菌感染方面具有巨大潜力。
图7.（a）通过菌落形成单位测定，工程水凝胶对被感染的牙本质生物膜模型的抗菌效力。条形柱上方的不同字母表示实验组之间的统计学差异（p<0.05）。（b）代表性的SEM图像，其描绘了评价区域，即，用作生物膜形成基质的牙本质切片的根管壁的内侧。（cf）用（c）2.5％GelMA-PDS-CIP-SF处理的牙本质样品表面细菌生物膜差异的代表性SEM图像，（d）2.5％GelMA-PDS-CIP /β-CD-IC- SF，（e）10％GelMA-PDS-CIP-SF和（f）10％GelMA-PDS-CIP /β-CD-IC-SF。（g）未处理（对照）牙本质样品的代表性SEM图像。注意生物膜和细胞外基质的大量存在。（b）中的白色正方形代表所有组的分析面积。白色箭头突出显示细菌细胞的存在。
【陈述总结】
在该工作中，通过建立游离形式的CIP/β-CD-IC或CIP验证了用环丙沙星（CIP）洗脱的短纳米纤维修饰GelMA的可行性。为此，已将CIP和CIP/β-CD-IC装入FDA批准的聚合物（聚二恶烷酮）电纺纤维中，并将其成功切成短纳米纤维，然后包埋在GelMA中，从而得到具有优化，可注射性的混合抗菌水凝胶成分。不出所料，CIP/β-CD-IC的合成改善了药物溶解度，继而在对细胞友好的同时又带来了最高的抗菌作用。此外，数据表明，取决于所选的GelMA浓度，降解曲线和药物释放动力学都可以进行微调。总的来说，工程聚合的CIP/β-CD-IC短纳米纤维GelMA平台有望为口腔和牙科感染消融提供疏水性药物，特别是在牙周和牙髓（即根管）应用中。但是，有必要进行进一步的研究来确定工程化杂化水凝胶作为治疗药物的微创递送载体的体内作用，不仅可以消融感染和/或解决炎症，而且还可以消灭具有已知再生特性的分子，从而使该技术可用于在牙科和医学中的广泛应用。
参考文献：
doi.org/10.1021/acs.biomac.0c01131
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