质粒的分类

1、克隆质粒

能在宿主细胞中复制扩增，用于测序和保存外源基因。这类载体具有最简单的组成基本元件（ori，Ampr/Kanar,MCS）,没有启动子等启动转录、翻译的元件。

2、基因（过）表达质粒

除克隆载体的基本元件外，还具有启动子等启动转录/翻译所必需的DNA序列。

3、基因敲除/敲降质粒

用于靶向基因敲除和定点编辑。含有目标基因的识别序列或目标基因mRNA的shRNA，实现切断目标基因或mRNA降解，起到基因表达沉默的效果，下调蛋白表达。

二、具备上述属性的源头——作用元件的存在

质粒图谱的认识

1.复制起始位点

Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。被宿主细胞复制因子所识别，利用宿主的复制机器，复制，增加拷贝数。因宿主复制机器不同，可分为原核/真核/穿梭质粒。

2.抗性基因

质粒转化是一个效率极低的过程，平均约10000个细胞中有1个细胞转化成功。想象一下，如果没有抗性基因的存在，筛选出阳性克隆的时间将大大延长。并且，外源性存在的质粒要进行复制等活动，会消耗宿主细胞自身的资源，在没有抗生素的培养基中，带有质粒的细胞不占优势，慢慢消失；在抗生素的存在情况下，抗性基因帮助宿主细胞分解抗生素，细胞才会需要质粒。

抗生素抗性基因：单词最后会以大写R或上标r结束。

Ampr 氨苄青霉素，水解 β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。

tetr 四环素，可以阻止四环素进入细胞。

camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。

neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使 G418（长那霉素衍生物）失活。

hygr 潮霉素，农杆菌里常用的。使潮霉素 β 失活

Kan（卡那霉素，常用）、Cmr（氯霉素，某些酵母表达质粒）、SM（链霉素）、

3.多克隆酶切位点 MCS

决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。商业化的质粒大多已人为地改造添加多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。

4.标签蛋白/报告基因

常见的标签如6×His、Myc、GST等；常用到的报告基因如β-半乳糖苷酶、GFP、荧光素酶等。

5.表达系统元件

即启动子（Promoter）-核糖体结合位点（RBS）-转录终止信号-增强子。

这是用来区分克隆载体与表达载体的。克隆载体中加入一些表达系统元件即成为表达载体。对于质粒发挥作用，至关重要！

启动子：是RNA聚合酶结合位点，位于基因表达框的上游。启动子序列控制RNA聚合酶与转录因子的结合，因此对于DNA何时何地转录至关重要。因宿主RNA聚合酶种类不同，质粒中的启动子类型也有所不同。P：这个一般是代表启动子。常见的启动子有：CMV、EF1（这俩是启动长片段的），H1、U6（启动短片段的，比如shRNA），35S、2×35S（做植物的应该懂的）。

核糖体结合位点：一般为AUG（起始密码子）。也常常会有SD序列，在起始密码子上游5-10bp处，同16s rRNA 3＇端互补。

Terms转录终止信号：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，下游有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。细菌表达质粒常见的终止子如T7，哺乳动物细胞质粒常见的终止子如SV40、SV40 late polyA、BGH等。加 poly（A）信号：可以起到稳定 mRNA 作用。pA：这个就是转录终止位点poly A。

增强子：为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。