「基因组学」使用OrthoFinder进行直系同源基因分析

分析流程

谈论到直系同源基因分析的时候，大部分教程都是介绍OrthoMCL，这是2003年发表的一个工具，目前的引用次数已经达到了3000多，但这个软件似乎在2013年之后就不在更新，而且安装时还需要用到MySQL（GitHub上有人尝试从MySQL转到sqlite）。

而OrthoFinder则是2015年出现的软件，目前已有400多引用。该软件持续更新，安装更加友好，因此我决定使用它来做直系同源基因的相关分析。

OrthoFinder能做什么？

OrthoFinder: solving fundamental biases in whole genome comparisons dramatically improves orthogroup inference accuracy提到，它的优点就是比其他的直系同源基因组的推断软件准确，并且速度还快。

此外他还能分析所提供物种的系统发育树，将基因树中的基因重复事件映射到物种树的分支上，还提供了一些比较基因组学中的统计结果。

如何安装？

最快的方法

OrthoFinder可以通过codna安装，建议为它新建一个虚拟环境

conda create -n orthofinder orthofinder=2.2.7

如果你愿意折腾

你先得安装它的三个依赖工具: MCL, FastME, DIAMOND/MMseqs2/BLAST+

MCL有两种安装方式，最简单的就是用sudo pat-get install mcl, 但是对于大部分人可能没有root权限，因此这里用源代码编译。http://micans.org/mcl/

wget https://www.micans.org/mcl/src/mcl-latest.tar.gz
tar xf mcl-latest.tar.gz
cd mcl-14.137
 ./configure --prefix=~/opt/biosoft/mcl-14.137
make -j 20 && make install 

之后是MMseqs2, 一个蛋白搜索和聚类工具集，相关文章发表在NBT, NC上。GitHub地址为https://github.com/soedinglab/MMseqs2

wget https://github.com/soedinglab/MMseqs2/releases/download/3-be8f6/MMseqs2-Linux-AVX2.tar.gz
tar xzf MMseqs2-Linux-AVX2.tar.gz
mv mmseqs2 ~/opt/biosoft/

最后安装FastME, 这是一个基于距离的系统发育树推断软件。在http://www.atgc-montpellier.fr/fastme/binaries.php下载，上传到服务器

下载

tar xf fastme-2.1.5.tar.gz
cd fastme-2.1.5
./configure --prefix=/opt/biosoft/fastme-2.1.5
make && make install

BLAST+可装可不装，推荐阅读这或许是我写的最全的BLAST教程

以上软件安装之后，都需要将其添加到环境变量中，才能被OrthoFinder调用。

之后在https://github.com/davidemms/OrthoFinder/releases 寻找最近的稳定版本下载到本地，例如OrthoFinder v2.2.7

tar xzf OrthoFinder-2.2.7.tar.gz
OrthoFinder-2.2.7/orthofinder -h

测试使用

在解压缩的OrthoFinder文件目录下有一个 ExampleData, 里面就是用于测试的数据集。

orthofinder -f ExampleData -S mmseqs
# -f 指定文件夹
# -S 指定序列搜索程序，有blast, mmseqs, blast_gz, diamond可用

运行结束后，会在ExampleData里多出一个文件夹，Results_Feb14, 其中Feb14是我运行的日期

直系同源组相关结果文件，将不同的直系同源基因进行分组

• Orthogroups.csv：用制表符分隔的文件，每一行是直系同源基因组对应的基因。
• Orthogroups.txt: 类似于Orthogroups.csv，只不过是OrhtoMCL的输出格式
• Orthogroups_UnassignedGenes.csv: 格式同Orthogroups.csv，只不过是物种特异性的基因
• Orthogroups.GeneCount.csv：格式同Orthogroups.csv, 只不过不再是基因名信息，而是以基因数。

直系同源相关文件，分析每个直系同源基因组里的直系同源基因之间关系，结果会在Orthologues_Feb14文件夹下，其中Feb14是日期

• Gene_Trees: 每个直系同源基因基因组里的基因树
• Recon_Gene_Trees：使用OrthoFinder duplication-loss coalescent 模型进行发育树推断
• Potential_Rooted_Species_Trees: 可能的有根物种树
• SpeciesTree_rooted.txt: 从所有包含STAG支持的直系同源组推断的STAG物种树
• SpeciesTree_rooted_node_labels.txt: 同上，只不过多了一个标签信息，用于解释基因重复数据。

比较基因组学的相关结果文件：

• Orthogroups_SpeciesOverlaps.csv： 不同物种间的同源基因的交集
• SingleCopyOrthogroups.txt： 单基因拷贝组的编号
• Statistics_Overall.csv：总体统计信息
• Statistics_PerSpecies.csv：分物种统计信息

高级选项

OrthoFinder默认用mafft进行多序列联配，用fasttree进行进化树推断。多序列联配软件还支持muscle, 进化树推断软件还支持iqtree, raxml-ng, raxml。例如参数可以设置为-M msa -A mafft -T raxml.

并行化参数: -t参数指定序列搜索时的线程数，-a指的是序列搜索后分析的CPU数。

一些重要概念:

• Species-specific orthogroup: 一个仅来源于一个物种的直系同源组
• Single-copy orthogroup: 在直系同源组中，每个物种里面只有一个基因。我们会用单拷贝直系同源组里的基因推断物种树以及其他数据分析。
• Unassigned gene: 无法和其他基因进行聚类的基因。
• G50和O50，指的是当你直系同源组按照基因数从大到小进行排列，然后累加，当加入某个组后，累计基因数大于50%的总基因数，那么所需要的直系同源组的数目就是O50，该组的基因树就是G50.

Orthogroups, Orthologs 和 Paralogs 这三个概念推荐看图理解。

概念辨析