闲言碎语

从今天开始转录组学习进入正题啦。
要重现的文章是

RNA-Seq Transcriptome Profiling Identifies CRISPLD2 as a Glucocorticoid Responsive Gene that Modulates Cytokine Function in Airway Smooth Muscle Cells

虽然不是做植物的，但是大体上都是相通的嘛。
数据存放在NCBI的GEO数据库，现在铺天盖地的都是关于GEO数据库挖掘的教程，比如我树就有GEO的教程，其他平台就更多了，不胜枚举。但是我好像似乎很少接触这个数据库（几乎没有），NCBI用的比较多的就是SRA数据库，有的时候用Taxonomy查一查物种分类信息，年轻的时候（本科二年级）还用过EST数据库（现在都已经被NCBI的别的数据库吞并掉了。官网显示：The Nucleotide database will include EST and GSS sequences in early 2019. ）。生信这一行要学的东西很多，会的越多就会发现不会的越多，没法以有限的生命去探索无限的生信的，选择自己感兴趣的方向就好了。

下面提供一个豆豆写的介绍各种数据库的文章，写得可好了，值得推荐：
💗点💗我💗看💗G💗E💗O💗数💗据💗库💗介💗绍💗

你也是~

数据下载

皮完了开始正题。

RNA-seq数据存放地址
根据文章介绍，数据存放在了GEO数据库的编号是GSE52778.
传送门：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE52778

这里讲个小技巧：观察一下上面这个链接，是不是搜的GSE52778在最后面?所以如果你想搜换一个编号，那就把最后的编号替换一下就好了。chrome有一个很好用的功能，在右上角的 设置→管理搜索引擎→其他搜索引擎，点击添加，按照下图的模式填写内容

添加搜索引擎
输入geo并按一下空格，就会启动使用GEO数据库搜索，这时候只要把要搜的编号打进去就好了，就能直接跳转到你输入的编号的GEO数据库位置了。
使用GEO数据库搜索

我们要的原始数据呢就放在这里啦：

到SRA数据库下载原始数据

什么嘛，原来又绕回到SRA数据库去了。

SRA数据库里有16个数据

野路子方法

点进来发现有16个数据，一般多个数据的序号都是连着的，按照我以前的彪悍做法呢，就直接写个循环都下载了，不要的下完了删掉。比如这里的SRR编号是SRR1039508 ~ SRR1039523刚好16个。
脚本如下：

# 直接用wget下载，-c参数是断点续传，可以在网络断开之后第二次从断开的地方继续下载，否则会从头开始下载噢
list={08..23}
for i in $list 
do
  wget -c ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR103/SRR10395${i}/SRR10395${i}.sra
done

# 用axel下载。前提是要先安装。我知道ubuntu系统是可以安装的， 别的系统就不知道了。安装需要root权限，也许也可以源码安装？
# sudo apt-get install axel

list={08..23}
for i in $list 
do
  axel ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR103/SRR10395${i}/SRR10395${i}.sra
done

记得用nohup把脚本挂后台下载。比如把这个脚本命名成dataDown.sh

nohup bash dataDown.sh &

你问我ftp后面这一串文件夹是怎么找到的？
无他，唯手熟尔。你要是天天到SRA数据库捞数据并且善于观察和记忆的话你也可以驾轻就熟的。

以上两种方法二选一。但是这毕竟是野路子，不管是工具还是过程。而且wget有下载不完全的风险，并且下载速度也不敢恭维。axel是一个多线程的下载工具，下载起来会比axel快一些，但是有很多站点是不支持axel下载的。

那正确的方法是什么呢？

正经方法

查看GSE的介绍：

四组处理

一共四组，每组四个生物重复。这到底用啥处理的？翻译一下了解一下：

1）没有治疗; 2）用β2-激动剂（即沙丁胺醇，1μM，18小时）处理; 3）用糖皮质激素（即地塞米松（Dex），1μM处理18小时）; 4）同时用β2-激动剂和糖皮质激素治疗

本次学习小组用对照组和Dexamethasone（第三组）进行学习。

image.png
点击如图的位置打开一个新的界面
image.png

根据描述勾选所需的数据，点击accession list按钮下载
用notepad++打开之后是这样的：

accession list

创建工作目录：

mkdir -p ~/rnaseq/{01raw,02clean,03ref,04qc,05align,06count,07script}

加上编号比较方便快速cd到想要去的文件夹。

软件安装

接下来用conda安装所需的软件
conda的安装教程可以参考我的这篇：
conda的安装与使用（2019-5-16更新）
（这篇简书已经有四万八千多的阅读量了……把我自己都吓到了）

# 创建一个新的用于rnaseq的环境，并安装sra-tools
conda create -n rnaseq sra-tools 
# 创建好后激活该环境
conda activate rnaseq

根据豆豆的这篇文章：来吧，加速你的下载
get 如何配置aspera来提高数据的下载速度

mkdir ~/biosoft
cd ~/biosoft
wget -c http://download.asperasoft.com/download/sw/connect/3.7.4/aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.tar.gz
tar -zxvf aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.tar.gz
chmod 777 aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.sh
bash chmod 777 aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.sh

安装过程中会有提示的：

Installing Aspera Connect

Deploying Aspera Connect (/home/xxx/.aspera/connect) for the current user only.
Restart firefox manually to load the Aspera Connect plug-in

Install complete

到家目录用ll -a查看是否存在一个.aspera的隐藏文件

cd ~
ls -a
tree .aspera

内容还挺丰富，tree的结果展示出了很多的文件及文件夹，就不放了。
把~/.aspera/connect/bin/ascp加入到环境变量中，以全局调用。

再讲一个小技巧。
在做生信的过程中难免装很多很多的软件，如果每次都把软件的文件夹加入到$PATH中会让$PATH变得很乱。那怎么办呢？
解决办法是设定一个特定的文件夹叫softlink，把它加入到~/.bashrc中，如果所安装的软件只有一个程序的话，在softlink中创建一个该程序的软连接即可全局调用该软件啦。

mkdir ~/softlink
echo 'export PATH=~/softlink:$PATH' >> ~/.bashrc
# 或者用vim编辑

cd ~/softlink
ln -s ~/.aspera/connect/bin/ascp .

这种方法只适用于单个可用程序的情况，如果安装的是一个文件包，里面有很多的脚本和程序可以用的话，还是老老实实的把整个文件夹加入到$PATH中噢。具体的方法我就不写了，可以去看豆豆的那一篇文章。

下载数据

因为我用的是windows平台，连接服务器用的是xshell，我可以直接将刚刚下载到本地的
SRR_Acc_List.txt通过拖动，拖到服务器上。但是需要用安装一个叫lrzsz的程序

apt-get install lrzsz

刚刚搜了一下，可以用源码安装lrzsz的。教程在此：Linux下rz/sz安装及使用方法

正式开始下载啦：

cd ~/rnaseq/01raw
# 直接把文件拖进终端
echo 'cat SRR_Acc_List.txt | while read i ;do prefetch $i -O `pwd` ;done' > dataDown.sh
time bash dataDown.sh

下完了 看了下时间

real  7m24.571s
user  0m49.040s
sys  2m22.474s

真香！

下载完成
下好数据啦！那么今天的任务就结束啦~
哪里看不懂的话我等我回去手把手的教你呀~ @小熊猫