背景

T细胞介导的抗原识别主要是依靠T细胞受体（TCR）和主要组织相容性复合体MHC的相互作用。如下图a：
TCR是一群具有高度多样性的二聚体，由α链和β链构成，或者由γ链和δ链构成，后者主要出现在外周血中，占1-5%。

TCR链由可变区和恒定区组成，α链或δ链由一段V和一段J基因编码，β链或γ链则多了一个D基因。在VDJ的重组过程中，每个基因片段的一个随机等位基因与其他基因片段重组形成一个功能可变区域。如下图b：

APC和T细胞的相互作用以及TCR的组成结构

可变区域与恒定区的重组形成功能性TCR链转录本。此外，核苷酸被随机添加和/或删除在基因片段之间的连接点。这一过程导致了大量的重组(取决于哪些基因区域将重组)和连接多样性(哪些和多少核苷酸将被添加/删除)，从而产生一个大的和高度可变的TCR库，这将确保识别过多的抗原。多样性是通过配对的α、β、γ、δ链而形成的功能性TCR。

每个TCR链都包含3个高变的线圈（three hypervariable loops），被命名为complementarity determining regions（CDR1-3），CDR1和2是由V基因编码的，是TCR与MHC复合体相互作用所必需的。CDR3是由V和J或者D和J连接的一段区域构成，因此具有高度多样性。CDR3因此也作为决定T细胞克隆类型的区域。因为两个T细胞不太可能表达相同的CDR3核苷酸序列，除非它们来自相同的克隆扩增T细胞。

一个单独T细胞中TCRs的总数被称为一个TCR repertoire或者叫做TCR profile。TCR库（TCR repertoire）会随着疾病的发生和发展而发生很大的变化，这也是为什么科学家们对在不同疾病条件下，如癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病和感染性疾病，确定其免疫库状态越来越感兴趣的原因。例如，Muraro等人用TCR库分析了自体干细胞移植对多发性硬化患者T细胞群的影响。在肿瘤中，细胞毒性T细胞可以杀死肿瘤细胞通过识别肿瘤特异性抗体。一些研究试图通过分析肿瘤浸润淋巴细胞库来确定参与这一过程的特定T细胞克隆类型。

研究免疫系统的主要挑战是其多样性。不同TCR基因的VDJ重组理论上可以产生10的15次方到10的20次方TCR链。尽管如此，据估计，人体中实际存在的克隆类型大约有10的13次方种，这意味着上述看似随机的TCR明显不是随机的而是受不同的约束的。

TCR 测序

高通量测序，和bulk测序pooled 免疫细胞，单细胞水平，illumina 测序平台，

大部分方法

目前提供测序的主流的商业公司有以下几个：

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选择目标序列：链和CDR区域

很多公司提供TCR链的所有文库制备和测序服务，但是α链和β链的仍然是最常见的目标，因为α和βT细胞构成了绝大多数T细胞群。纵观历史，β链是主要的研究对象，由于它在组成上多了一个D基因，β链在T细胞中也是独一无二的，反之，同一个细胞可以表达两个α链都是有可能的，这也增加了复杂度。γδ T细胞受体现在研究的不是很广泛，因为γδ T细胞只占T细胞总数的一部分。跟αβ TCRs相比，γδ TCRs的总体多样性就很低，并且有一个解刨学定位的分析，分析了γδ T细胞在粘膜位置上的丰度偏向更高,因此，在外周血样本中对其研究兴趣较小。基于PCR扩增的方法可以同时扩增α 和β 链，但是在文库构建和测序的时候，人们一般会将它们分开成为两个样品去处理这两个链。这已经被发现可以提高结果的准确性和特异性。

CDR3区域由于与TCR-肽相互作用的相关性，成为许多TCR序列研究的首选靶点。迄今为止，CDR1和CDR2并没有引起科学界的关注，因为它们与抗原没有直接相互作用。然而，CDR1和CDR2在与MHC分子的接触中发挥重要作用，从而影响TCR结合的敏感性和亲和力。了解包括CDR1和CDR2在内的整个转录本的序列，可能是对TCR结构及其结合特性建模的一大优势。并不是所有的方法都能够检测CDR1和CDR2。这种限制尤其适用于使用多个引物序列的方案。事实上，许多等位基因特异性引物被设计在V基因的不同位置，常常排除了CDR3之外测序的可能性。

文库制备的方法：

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多重PCR（Multiplex PCR）

由于TCR的多样性，多重PCR方法是最广泛使用的方法之一， Adaptive Biotechnologies，BGI华大基因，和iRepertoire等很多公司都提供定制服务或试剂盒。引物的恒定区J等位基因或细胞受体α和β链一起使用的所有已知的V等位基因的引物。这导致了TCR转录本在CDR3区域的特异性扩增。该方法可用于gDNA和RNA，并已发表的协议，确保在扩增过程中没有交叉引物干扰。然而，由于使用固定的引物，该方法不能检测新的V等位基因变异。此外，多重PCR方法存在扩增偏向性，导致某些等位基因扩增效果优于其他等位基因，从而扭曲了产物的相对丰度。通过具体的实验设计(包括调整引物浓度和/或使用barcode)来纠正这种错误是可能的。

目标富集（Target enrichment）

有针对性的浓缩方法可以使用例如安捷伦的RNA baits捕捉T细胞α和β链。对于起始材料，gDNA或RNA首先用标准测序文库制备试剂盒(即安捷伦公司的Illumina TruSeq或SureSelectXT)处理，然后用定制的RNA baits孵育样本。这些RNA baits是对感兴趣的序列的补充，与目标相比可以耐受一些不同的碱基，它们与gDNA/cDNA目标杂交，然后允许捕获它，并将捕获的gDNA/cDNA提交到所需序列的进一步放大步骤。与其他方法相比，这种方法需要更少的PCR周期，因此更不易受到PCR偏向性的影响。α和β链也可以一起处理,同时建议独立的处理两个链其他方法以增加结果的质量。

5'RACE cDNA 合成和巢式PCR

TCR分析的常见问题

UMI（unique molecular identifiers）

UMIs值得特别注意，UMIs能够绝对定量RNA转录本的数量，它包含几个随机的碱基，在cDNA合成的时候插入到模版中和目标分子连接。因此，每一个cDNA分子都会有一个不同的UMI，在数据分析的时候，通过PCRs和测序可以检索来自同一mRNA分子的序列。

测序平台和测序深度

外包和自制的方法

数据分析

展望：单细胞方法

BMC Published online 2017 Jul 10.