Novel Tumor-Specific Antigens for Immunotherapy Identified From Multi-omics Profiling in Thymic Carcinomas
从胸腺癌的多组学分析中发现免疫治疗的新型肿瘤特异性抗原
发表期刊：Front Immunol
发表日期：2021 Nov 16
DOI: 10.3389/fimmu.2021.748820
期刊相关信息
一、背景
胸腺癌（TC）是世界上极为罕见的恶性肿瘤，只占胸腺上皮肿瘤（TETs）的少数。根据世界卫生组织（WHO）的组织学等级分类，TC是分化较差的TETs，其临床病程比胸腺瘤更具侵袭性，5年生存率为36%。
越来越多的证据表明，TC很少与副肿瘤性自身免疫性疾病相关，并显示出PD-L1的高表达，PD-L1通过与PD-1结合抑制细胞毒性T细胞的反应，从而降低其抗肿瘤免疫力。这些发现促使人们使用免疫检查点抑制剂（ICI），它可以阻断CTLA-4、PD-1及其配体之间的相互作用，作为TC的一种替代治疗方案。新抗原由特定的主要组织相容性复合物（MHCs）呈现并被T细胞识别，在免疫治疗中也发挥着重要作用。最常研究的用于治疗性疫苗的新抗原来自非同义的单核苷酸变体（SNVs）。
二、材料与方法
1.数据来源
22名TC患者：从19名TC患者的肿瘤和邻近的正常新鲜冷冻样本中获取了平均深度为100X的高质量WES数据，其中8名患者也有足够的质量可用于RNA测序（RNA-seq）；仅有肿瘤的RNA-seq数据集是从另外3名TC患者身上收集的。
2.实验流程
1）全基因组加倍(WGD)：如果超过50%的常染色体基因组的主要拷贝数来自FACETS大于或等于2，则认为患者经历了WGD
2）计算染色体不稳定(CIN)：CIN负担被定义为受CNAs影响的基因组长度比例
3）激活的端粒维持机制：TelomereHunter（v1.1.0）被运行来量化全基因组测序样本（n=4）上10种端粒重复类型的含量
大规模基因组事件分析
微卫星不稳定性鉴定
预测主要组织相容性复合体结合的短肽变体
预测由基因融合产生的主要组织相容性复合体结合的新抗原
三、实验结果
01 - TC的基因组非整倍体和端粒维护
体细胞拷贝数改变（SCNA）分析显示，在TC患者中，五个反复扩增和删除的区域更频繁地出现在染色体臂水平。1q染色体的臂级增殖存在于绝大多数患者中（图1A）。19个样本中，有12个存在16q染色体的丢失。同样，在本队列中，经常复发的臂级损失涉及6号染色体。值得注意的是，在寻找新的SCNAs时，检测到17q染色体的富集，这在以前的TC中没有报道过。
作者进一步研究了发生在含有已知驱动基因的扩增和删除峰内的SCNAs，其中包括1q21.3的ARNT基因座的显著局灶性增殖/扩增，这主要发生在本研究队列中（图1B）。在32%的肿瘤中，JAK3、PIK3R2和CRTC1在19p13.11反复扩增/增益。两名患者在15q11.2发现的病灶增殖包括大多数推定的驱动基因，包括USP8、MAP2K1、NTRK3、IDH2、FES和IGF1R。同样，对16q23.2的病灶SCNA的评估显示FANCA的丢失频率增加。在9p21.3的TC中，分别有16%和11%的CDKN2A和CDKN2B的失活。在19p13.3反复出现的病灶SCNA包括TCF3的缺失。基于这些SCNA谱，基因本体论（GO）术语分析表明，TC的进展可能得益于蛋白酪氨酸激酶活性的失调和细胞增殖的调节。
此外，通过确定受SCNAs影响的基因组的长度比例，分析了CIN负担，结果显示队列中CIN负担较低。在临床上，大规模的基因组事件，如WGD，经常与癌症进展中较差的生存率有关。一名TC患者表现出WGD，同时有更大程度的CIN。值得注意的是，臂级SCNA的负担在WGD阳性患者（TC10）中富集携带了所有的基因级驱动SCNAs（图1B）。
图1 胸腺癌的体细胞拷贝数改变（SCNAs）的情况
作为一个探索性和推测性的分析，利用TelomereHunter进一步分析了4个配对的全基因组测序数据，以研究TC的端粒维持机制。总的来说，肿瘤样本的端粒含量与匹配的对照组相似，端粒含量的中位数肿瘤/对照组对数比为0.04），并没有显示出采用替代性延长端粒途径的趋势。相反，在肿瘤样本中观察到TERT的表达明显增加，表明它们依赖于重新激活典型的端粒维持。
02 - TC患者突变景观与负担与免疫原性的相关性
对数据进行调查后发现，癌症基因组图谱（TCGA）和本研究队列之间的TMB中位数没有任何差异（排除高突变的病例，P=0.60）。在本研究队列中，一名TC患者（TC08）显示出明显的高TMB（图2A）。正如预期的那样，仅使用先前验证的截止分数（> 10）将超突变样本归类为 MSI-high。
为了确定队列中显著突变的基因（SMG），在过滤了一个高突变的病例（TC08）后，作者确定了一个基因KMT2C，该基因在以前的TC研究中没有作为SMG报道。KMT2C在两个样本中发生了改变，这两个样本主要包含了具有高功能影响的帧移印迹（图2A，中间）。将KMT2C的突变率与TCGA数据集进行比较，发现仅在本研究队列中普遍存在（图2A，右）。对SMG的额外分析选择了2个众所周知的TC驱动基因TP53和CYLD，并确定了2个额外的SMG，即NF2和ALPK3。然后将这4个额外确定的SMG的频率与TCGA队列进行了比较。NF2和ALPK3基因在两个队列中显示了相似的突变率，而TP53和CYLD在本研究队列中受影响的频率较低（图2A）。
接下来，为了探索队列中潜在的癌症基因的情况，作者整理了以前两个TC研究中报告的12个经常复发的基因的列表，也评估了从癌症基因普查中挖掘的基因。在本研究队列中，共有10个癌症基因被确定为驱动因素（图2A，中间），包括KMT2C、TP53、CYLD、NCOA1、NOTCH1、NSD1、WHSC1L1、BAP1、CDKN2A和PBRM1。其中，7 个基因在不止一个病例中反复发生突变，而 3 个精选基因（BAP1、CDKN2A 和 PBRM1）在受影响的患者中偶尔发生改变。关于作者确定的癌症基因，发现与TCGA病例相比，大多数基因只在中国患者队列中被鉴定出来（图2A，右），这意味着不同种族之间存在着明显的基因组差异。
越来越多的证据表明，免疫疗法可以在治疗上加强主动免疫监测。潜在的新抗原是根据体细胞SNVs和indels来计算预测的，预测的新抗原在所有患者中的中位数为10个。其中，有两个相关基因被反复确认，包括一个SMG，KMT2C，和一个潜在的驱动基因CYLD（图2B）。除了 KMT2C 和 CYLD 的突变之外，只有 MOK 中的移码缺失会导致在一名患者中发现四种新抗原产物。正如预期的那样，新抗原负担与TMB的升高显著相关，MSI高病例的新抗原负荷（n = 209）异常高于其他样本（图2A，顶部），特别是帧移缺失负担较高的帧移缺失所产生的肽类增加。
图2 胸腺癌患者的致癌性改变与新抗原的重复性(n = 19)
03 - 来自正常组织的早期肿瘤发生，免疫原性的基因融合以及免疫细胞在配对组织中的浸润
通过RNA-seq数据对11名患者的复发性基因融合进行了进一步描述，以描绘出完整的突变画像，结果显示11名患者中的10名有潜在的基因融合。图3A（中间）显示了每个病人预测的基因融合的频率。在本研究队列中，最常见的融合是USP22-RN7SL2，其中USP22一般有较长的保留外显子，这些外显子伴随RN7SL2的外显子1重排。另一个最常见的融合，CATSPERB-TCN，被预测为转化为一种新的融合蛋白（图3B）。
图3 胸腺癌患者相邻正常组织中具有新抗原和体细胞改变的基因汇辑（n = 11）
作者在本研究队列中进一步调查了由基因融合产生的新抗原。分析表明，在10名受影响的患者中，有5名患者的融合产物具有潜在的免疫原性（图3A，顶部），尤其是复发性融合CATSPERB-TCN（图3B）。此外，在受影响的患者中，预测的新抗原中位数为3个。在这一组中，AASDH-KLHL5的预测新抗原候选者数量最多，其次是N4BP1-SIAH1。值得注意的是，每个融合体有0.60个预测的潜在免疫原性表位，而每个SNV/inframe indel有0.47个，每个frameshift indel有0.53个（排除高突变病例），在非融合体衍生的新抗原负担较低的患者中数值更高（图4）。
图4 三类改变所产生的预测新抗原候选物的比较
为了探索8个配对的肿瘤和正常组织的免疫浸润的细胞特征的差异，采用CIBERSORTx算法来估计每个样本的22种免疫细胞类型的组成。与配对的正常组织相比，巨噬细胞M0、巨噬细胞M1和单核细胞在肿瘤组织中明显增加（补充图S6），在肿瘤组织中也发现了较高比例的活化树突状细胞。相比之下，幼稚B细胞、静止自然杀伤（NK）细胞和幼稚CD4+T细胞在正常组织中更为丰富。综上所述，这些结果表明，基于肿瘤浸润免疫细胞的不同组成，肿瘤和匹配的正常组织的免疫功能存在差异。
补充图S6 成对的肿瘤和正常组织之间的免疫细胞组成比例
由于调查邻近正常组织或癌前病变中的体细胞突变可能为肿瘤的发生和发展提供有价值的见解，使用RNA-MuTect和Cancer Transcriptome AnalysisToolkit（CTAT）-Mutations管道的进一步分析显示了早期宏观体细胞克隆扩张。根据SIFT和PolyPhen2的预测，GPX2突变会有害地改变蛋白质的功能，它被认定为正常组织中的一个假定驱动因素，以及PPDPF的一个剪接位点缺失（图3A，中间）。总的来说，这些改变可能对早期肿瘤的发生起着重要作用。
04 - TC的可操作性
为了研究潜在的可操作性药剂是否可以成为有价值的预测性生物标志物，并为TC患者提供额外的治疗选择，作者特别关注上述已确定的驱动因素和分子特征。这些特征包括 (1）高突变或/和MSI高表型的免疫治疗；以及（2）OncoKB数据库中收录的具有不同证据水平的特定改变。根据这些原则，计算了具有这些事件的TC患者的百分比。总的来说，47%的肿瘤（n=9）至少有一种可用于目前FDA批准的药物或被纳入未来的TC临床试验的药剂（图5A）。
在本研究队列中再现的OncoKB可操作的改变显示了3个潜在的目标（图5B），包括CDKN2A、FLG和ERBB2。两名患者存在CDKN2A突变/缺失，这有令人信服的生物学证据（4级），预测对所有肿瘤类型的药物有反应。此外，四名患者有FLG扩增，可能用注册用于肺鳞状细胞癌而不是TC的药物治疗。同样，一名ERBB2扩增的患者提出了抗HER2疗法可能被用于TC的临床试验中。最后，如前所述，有一个肿瘤被确定为高突变（TMB>10mut/Mb）和MSI高，SNV/indel衍生的新抗原负担比其他样本高（图5C），这个肿瘤可能对pembrolizumab（已批准用于所有实体瘤）有反应/敏感。
图5 癌症与免疫的相互作用，为胸腺癌提供可操作的生物标志物
四、结论
本研究可能对理解新抗原的选择有重要意义，也可能对TC的其他治疗选择有可操作的生物标志物。全面的突变景观也可能对胸腺癌的生物学提供有价值的见解。重要的是，需要更多的TC样本来验证发现，以便提供进一步的临床措施和验证，仔细确认免疫原性。尽管TC的分子机制仍然是一个研究不足的领域，但本研究将有助于形成对其基因组特征的看法。
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