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Trim Galore ——自动检测adapter的质控软件

Trim Galore ——自动检测adapter的质控软件

作者: 六六_ryx | 来源:发表于2018-07-18 12:59 被阅读5次

    之前分析过的测序数据,数据质量都很好,给了我一个错觉质控的前后差别不是很大,内心里对质控这一步也就不是很重视,跑完质控有时也懒得看结果,拿到一批测序数据后,也总是忽略了去看测序策略是什么,按照固定的流程用fastqc做质控和trimmomatic去除adpater和低质量的碱基,结果今天翻车了!!
    批量跑完了20个数据的ATAC-seq流程,结果发现样本的比对率参差不齐,有的能达到80-90%,有的却低于50%,回过头来找原因发现cleandata中的adpter并没有去除,也就是说我用的adapter并不是建库所用的,那么怎么知道这批数据建库时用的什么adapter呢?
    求助了健明师兄,他推荐我使用Trim galore做质控,并且一眼看出我这个测序策略是nextseq(不知道他怎么看出来的)。
    查了一下Trim galore,是可以自动检测adapter,也发现了自己的错误,trimmomatic只是针对Illumina高通量测序平台设计的接头去除和低质量reads清洗软件,Nextera的接头和它是不一样的(基础知识很重要!!!)。
    下面就对Trim galore的下载,安装和使用做一个简要介绍,并总结了另外两个质控软件Trimmomatic 和cutadapter 的使用。

    raw_data /clean_data

    1. Trim galore简介

    Trim Galore是对FastQCCutadapt的包装。适用于所有高通量测序,包括RRBS(Reduced Representation Bisulfite-Seq ), Illumina、Nextera 和smallRNA测序平台的双端和单端数据。主要功能包括两步:
    第一步首先去除低质量碱基,然后去除3' 末端的adapter, 如果没有指定具体的adapter,程序会自动检测前1million的序列,然后对比前12-13bp的序列是否符合以下类型的adapter:

    • Illumina: AGATCGGAAGAGC
    • Small RNA: TGGAATTCTCGG
    • Nextera: CTGTCTCTTATA

    2. 下载安装软件 trim galore

    conda安装

    conda install trim-galore
    
    conda 环境配置
    conda安装时可以看出依赖的环境很多,我们的大机环境很复杂,我并没有安装成功。

    下载安装包安装:
    下载安装包安装很简单,下载后解压,配置下环境变量就可以使用。
    ## 需先安装fastqc和cutadapt
    wget https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore/archive/0.4.5.tar.gz
    tar zxvf 0.4.5.tar.gz
    

    3.使用

    # 处理双端测序结果
    echo " trim_galore cut adapters started at $(date)"
    trim_galore -q 20 --phred33 --stringency 3 --length 20 -e 0.1 \
                --paired $dir/cmp/01raw_data/$fq1 $dir/cmp/01raw_data/$fq2  \
                --gzip -o $input_data
    echo "trim_galore cut adapters finished at $(date)"
    

    参数说明:

    --quality:设定Phred quality score阈值,默认为20。
    --phred33::选择-phred33或者-phred64,表示测序平台使用的Phred quality score。
    --adapter:输入adapter序列。也可以不输入,Trim Galore!会自动寻找可能性最高的平台对应的adapter。自动搜选的平台三个,也直接显式输入这三种平台,即--illumina、--nextera和--small_rna。
    --stringency:设定可以忍受的前后adapter重叠的碱基数,默认为1(非常苛刻)。可以适度放宽,因为后一个adapter几乎不可能被测序仪读到。
    --length:设定输出reads长度阈值,小于设定值会被抛弃。
    --paired:对于双端测序结果,一对reads中,如果有一个被剔除,那么另一个会被同样抛弃,而不管是否达到标准。
    --retain_unpaired:对于双端测序结果,一对reads中,如果一个read达到标准,但是对应的另一个要被抛弃,达到标准的read会被单独保存为一个文件。
    --gzip和--dont_gzip:清洗后的数据zip打包或者不打包。
    --output_dir:输入目录。需要提前建立目录,否则运行会报错。
    -- trim-n : 移除read一端的reads


    其他质控方法:

    Trimmomatic

    Trimmomatic是针对Illumina高通量测序平台设计的接头去除和低质量reads清洗软件。软件中包括有Illumina平台常见接头序列,可以很方便处理单端和双端RNA-seq数据。Trimmomatic也支持自己设计要去除的接头序列文件。
    运行代码:

    ## 双端测序
    echo "trimmomatic cut adapters started at $(date)"
    java -jar /software/biosoft/software/Trimmomatic-0.36/trimmomatic-0.36.jar PE -threads 8 $dir/cmp/01raw_data/$fq1 $dir/cmp/01raw_data/$fq2 \
    $input_data/$sample\_paired_clean_R1.fastq.gz \
    $input_data/$sample\_unpair_clean_R1.fastq.gz \
    $input_data/$sample\_paired_clean_R2.fastq.gz \
    $input_data/$sample\_unpair_clean_R2.fastq.gz \
    ILLUMINACLIP:/software/biosoft/software/Trimmomatic-0.36/adapters/TruSeq3-PE-2.fa:2:30:10:1:true \
    LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:50 TOPHRED33
    echo "trimmomatic cut adapters finished at $(date)"
    

    重要参数解释

    • -threads:设置线程数目。

    • -phred33:选择-phred33或者-phred64,表示测序平台使用的Phred quality score。查询方法:首先,运行FastQC,在结果报告第一项会“猜出”测序平台。之后,查询平台对应Phred列表

    • -trimlog:输出运行日志。日志中包括对每一个read具体选择数据,所以文件会比较大。

    • ILLUMINACLIP:跟随四个参数,分别是:<fastaWithAdaptersEtc>为adaptesr文件完整路径(在Trimmomatic的默认安装目录下的 adapter,有整理好的);<fastaWithAdaptersEtc>为seed matches(16bases)在匹配时的最大错配数目;<palindrome clip threshold>对于一对reads当得分超过30(约50 bases),seeds会被延伸和固定;<simple clip threshold>,对于单端reads当得分超过10(约17 bases),seeds会被延伸和固定。

    • LEADINGTRAILING:分别为去除read头部和尾部的低质量(低于quality3)碱基数目。

    • SLIDINGWINDOW:跟随两个参数,分别是 <windowSize>为扫描“窗口”长度;<requiredQuality>为窗口碱基质量的平均阈值,低于此会被删除。

    • MINLEN:设置最短reads数目。需要根据下游alignment软件设定,比如Bowtie适用于短序列,比如50bp以下;而Bowtie2适用于50bp以上。TopHat 则根据实际使用Bowtie或者Bowtie2选择。

    FastQC

    FastQC是用于对二代测序数据质量快速检验的工具,可以输入fastq(fastq.gz)、sam或者bam文件。查看输出结果解释。可以联合multiqc使用,查看多个qc的报告。
    代码示例:

    echo "fastqc started at $(date)"
    ###method (3)
    fastqc -o $dir/cmp/qc $dir/cmp/01raw_data/*gz
    #multiqc *fastqc.zip --ignore *.html
    echo "fastqc finished at $(date)"
    

    cutadapter

    cutadapt -q 30 -b CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA --minimum-length 20 --overlap=5 -o tmpl1.1.fastq --paired-output tmpl1.2.fastq SRR2920469_1.fastq.gz SRR2920469_2.fastq.gz
    

    参考资料:

    清洗二代测序数据
    Trim Galore User Guide

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