hello，大家好，周四了，一周又将过去，情绪丝毫没有缓解，现在我是真的羡慕当一个女人，女人的优势比男人太大了，男人有时候必须向生活低头，无奈做出选择。
今天我们继续分享空间转录组的分析内容，文章在Spatial transcriptomic analysis of childhood ependymoma implicates unresolved wound healing as a driver of tumor progression，说起来昨天明明写了一篇，但是简书给封了，见了鬼了，科普类的文章都封，不过我要提醒大家，空间转录组目前发的文章都非常高，是个绝佳的机会，如果做了空间转录组的话，抓紧时间。
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Abstract
儿童室管膜瘤 (EPN) 是一种脑肿瘤，在过去几十年中其结果改善有限。最近，单细胞 RNA 测序 (scRNAseq) 揭示了 EPN 的潜在细胞成分，提供了生物学见解。在这里，使用空间转录组学全面绘制后颅窝 A 亚组 (PFA) EPN（最常见和最致命的 EPN 变体）细胞landscope中的基因表达图，为细胞异质性和细胞相互作用提供新的解决方案。研究揭示 PFA 由上皮和间充质组织学区域组成，每个区域都包含多种细胞状态。These include co-existing and spatially distinct undifferentiated progenitor-like clusters - a quiescent mesenchymal zone population, and a second highly mitotic progenitor population that is restricted to hypercellular epithelial zones。骨髓细胞相互作用是 PFA 间质转化的主要原因，发生在空间上与缺氧诱导的间质转化不同的区域，并且这些不同的 EMT 启动过程在 PFA 的体外模型中得到了验证。总的来说，转录组和功能分析反映了正常伤口愈合的过程，其中 PFA 间充质和上皮区域在持续组织损伤反应和有丝分裂再上皮化信号的循环中与免疫亚群相互作用。空间转录组学提高了对 PFA 生物学的理解，将“wound that will not heal”过程作为肿瘤进展的驱动因素，这一新概念可以为有效的治疗干预提供新的靶点。
Significance
室管膜瘤肿瘤微环境的空间转录组分析确定了新的细胞群和相互作用，暗示未解决的伤口愈合是这种难治性儿童脑肿瘤中肿瘤进展的临床可操作驱动因素。
Introduction
脑肿瘤是儿童期癌症死亡的主要原因。 室管膜瘤 (EPN) 是儿童中第二常见的恶性脑肿瘤 (9%)，结果的改善已经停滞。 尽管目前的标准治疗包括手术切除和辅助放疗，但超过 50% 的 EPN 儿童会复发，其中大多数最终会在长期多次复发后死亡。 在复发时使用化疗的临床试验失败了，主要是由于缺乏生物学驱动的试验。 迫切需要特别基于识别驱动 EPN 肿瘤进展的因素的创新和合理的治疗方法。
对儿童 EPN 理解的最新进展依赖于分子、基因组、转录组和甲基组技术。 分子分层已经描绘了两个主要的 EPN 亚组，它们由解剖位置定义 - supratentorial and posterior fossa - 后者在儿童时期更为常见，主要由后颅窝亚组 A (PFA) 组成。 近年来，EPN 肿瘤微环境 (TME) 的细胞异质性已经使用单细胞 RNA 测序 (scRNAseq) 绘制出来，识别出多种肿瘤细胞类型，包括未分化的祖细胞、室管膜和间充质分化的progeny。 在本研究中，通过利用空间转录组学 (ST) 将显微镜、分子和单细胞方法联系起来，以确定推动 PFA EPN 进展的新机制。
Results
Spatial transcriptomics reveals that the PFA TME is comprised of epithelial and mesenchymal zones
ST 用于使用 Visium 平台 (10x Genomics) 将转录组数据映射到 PFA 中的肿瘤细胞结构上。 分析了 14 个（11 个原发性；3 个匹配复发）速冻手术切片，代表一系列 PFA 分子和临床变量（PFA1/PFA2 亚组分类、染色体 1q gain、来自 1 岁以下患者的样本和来自 WHO grade II and III）。 ST 测序数据经过处理和过滤，在 14 个样本中产生 33,082 个spot（每个样本约 2,400 个spot）。 每个样本的spot通过批次校正/alignment进行聚类，确定了 23 个 ST clusters，其中 18 个存在于所有 14 个样本中。 在形态学上，PFA EPN 的典型特征是细胞密度不同的区域，occasionally arranged in rosettes。 ST clusters的组织学排列反映了 PFA 细胞景观中的这种形态异质性
使用 3 种方法检查来自每个cluster的转录组图谱，以表征不同clusters下的细胞组成：（i）ST cluster标记基因与先前鉴定的 PFA scRNAseq 亚群标记基因的 Jaccard 指数比较； (ii) ST clusters相似度的clusters tree分析； (iii) ST 标记基因的GO分析。SPOT（直径 55μm）由多个细胞组成，范围为 1-30 个细胞，具体取决于组织学区域的潜在细胞结构。因此，ST clusters主要代表细胞的保守复合物，而不是单个细胞类型，因此与使用 scRNAseq 鉴定的单个细胞的转录组图谱不完全可比。尽管有这个差异，但 3 种表征方法的汇总结果能够在每个主要 ST clusters中识别出由 scRNAseq 识别的主要肿瘤或免疫细胞类型。之前对 PFA 的 scRNAseq 分析确定了四个主要的肿瘤亚群。分析了两种室管膜分化细胞类型，纤毛 EPN 细胞 (CEC) 和转运 EPN 细胞 (TEC)，分别以表达与正常室管膜功能相关的基因和蛋白质为特征，例如纤毛相关基因 CAPS 和 FOXJ1，或转运蛋白，包括AQP4 和 VIPR2。间充质亚群（MEC；间充质 EPN 细胞）通过 MEC 标记 CA9 的免疫组织化学 (IHC) 显示到边界坏死区。通过 IHC 使用 UEC 标记 c-fos，可以看到称为未分化 EPN 细胞 (UEC) 的祖细胞群与 MEC 相关。这些发现在其他 scRNAseq 研究中得到证实。这四个 scRNAseq 肿瘤细胞亚群在 ST clusters中差异富集（Jaccard 指数分析），并相应地注释了 ST clusters。 EPN 产生于中枢神经系统的心室，并被理解为来自正常的室管膜细胞，一种排列在心室的上皮细胞类型。因此，TEC/CEC 亚群代表上皮分化的 EPN 细胞类型。因此，聚类被分为主要的肿瘤上皮和间充质分支，分别以 TEC/CEC 和 MEC 亚群为主。通过所有 14 个样本的 UMAP 2D 投影，也可以看到上皮和间充质 ST clusters分离。间充质 ST clusters分支代表已在 PFA 中确定的上皮间充质转化 (EMT) 过程。 ST clusters的组织学检查显示大多数样本由广泛的上皮或间充质 ST spot区域组成。正如预期的那样，上皮区域与细胞形态相关，显示出rosette-rich and highly cellular areas。相反，间充质区通常是中等或稀疏的细胞，并与坏死区域相关。 ST clusters比例提供了一个比 scRNAseq 的数据更可靠地量化亚群比例的机会，因为 ST 是对相对未经处理的组织的直接测量，而 scRNAseq 涉及许多可能扭曲细胞比例的组织处理步骤。平均而言，上皮区spot在 PFA 中比间充质更丰富（平均 1.7:1，n=11），但具有高水平的变异性（范围 3.0:1 至 1:5.6）。具有高间充质：上皮比率的 PFA 包含大的粘性间充质区域，其最小尺寸通常大于 1mm，而具有较高上皮：间充质比率的样品包含散布在上皮区域内的间充质spots。上皮和间充质区都包含多个 ST subclusters，但具有显著的空间和分子差异。
其余的 ST clusters主要与非肿瘤细胞特性相关。一个单一且相对丰富的 ST cluster与包括 VWF 和 PECAM1 在内的血管内皮 (VE) 基因表达相关，占据了一个专有的 Clustree 分支。这一发现突出了 ST 的额外优势，因为这种细胞类型在之前的单细胞 RNAseq 分析中没有发现，可能是由于 VE 的内聚性排除了成功捕获所需的机械分解成单细胞。许多 ST cluster以髓系免疫细胞基因特征为主，以经典巨噬细胞/小胶质细胞标志物（如 HLA-II 类）、缺氧相关GO或趋化因子表达进行区分。其他两个 ST clusters以血红蛋白基因特征为主，随后显示其存在于具有组织学证据的出血区域（含铁血黄素），或线粒体基因的高表达。单个样本 (928_2) 包含与肿瘤相邻的正常脑区域，以小脑颗粒层 (CGL) 细胞为主，被视为离散的 ST clusters。该cluste以及 6 个最少丰度的 ST clusters，每个仅出现在 1 或 2 个样本中，被排除在本研究的其余部分之外。
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Mesenchymal zones are comprised of spatially restricted EMT stages in PFA
最近的 scRNAseq 研究进一步阐述了 PFA 中 EMT 的过程，表明在缺氧培养条件下可以在 PFA 细胞系中诱导 EMT。 然而，除了缺氧之外，包括营养缺乏、细胞应激和组织损伤在内的许多外在和内在刺激都可能触发原位 EMT 的启动。 ST PFA 间充质区由 5 个 ST clusters组成，这些clusters富含 MEC scRNAseq 标记。 间充质区 ST clusters之间的区别可能代表不同的 EMT 刺激，或者 EMT 过程中的不同过渡状态。 为了检验这些假设，检查了间充质区 ST clusters在基因表达和空间排列方面的差异。
在 5 个间充质区clusters中，一个cluster的特征在于早期反应基因（如 FOS 和 JUN）的高表达，这些基因也是 scRNAseq UEC 祖细胞亚群的标记，因此被标记为 UEC-B。其余 4 个间充质区 ST clusters按丰度顺序标记为 MEC-A、MEC-B、MEC-C 和 MEC-D。之前的 scRNAseq 研究使用 c-fos IHC 来绘制 UEC 相对于其他肿瘤亚群的空间位置，揭示 UEC 与 MEC 在坏死周围和血管周围区域的关联。因此，可以看到 UEC-B 位于间充质区clusters附近。细胞类型之间的空间接近度是它们在 TME 中的生物学作用的一个重要因素。因此，系统地计算了所有 14 个样本中所有 18 个主要 ST clusters的点间距离。这证实了 UEC-B 与其他间充质区clusters的空间关系比上皮区clusters更紧密。GO分析表明，UEC-B 与其他间充质区亚群的区别在于与 Pol-II 启动子的转录激活相关的GO，但与特定的 MEC 亚群，特别是 MEC-D，对缺氧和典型糖酵解有共同的反应，consistent with the commonalities between UEC-B and MEC-D seen by Clustree analysis。
the most abundant的间充质区亚群 MEC-A 的特点是富集与 MHC-II 类和补体相关的免疫基因。 当映射到 scRNAseq 数据时，MEC-A clusters补体相关标记基因主要局限于肿瘤 MEC 亚群而不是免疫细胞。 这些包括关键补体成分 1 基因 C1S、C1R 和 CFB，表明经典补体级联的肿瘤细胞内在激活。 丝氨酸蛋白酶抑制剂 SERPINA3 是 MEC-A 中的顶级标志物，对作为丝氨酸蛋白酶的补体成分 1 因子发挥潜在的细胞保护作用。 相反，MEC-A MHC II 类基因（HLA-DRA、HLA-DRB1）和补体级联成分 C3 标记基因更局限于 scRNAseq 骨髓细胞，表明 MEC-A ST subclusters由 MEC 和骨髓细胞的混合物组成 ，正如 Jaccard 指数分析所见。
MEC-D cluster通常呈现为细胞过多上皮区域内的islands，并且通过更多细胞过多的组织学在显微镜下与其他 MEC subclusters区分开来。 糖酵解基因，包括 GAPDH、TPI1 和 LDHA，在 MEC-D 中富集。 糖酵解代谢的上调是细胞对缺氧做出反应的标志，缺氧相关基因，特别是血管生成 VEGFA，在 MEC-D 中显著富集。 这表明 MEC-D 是由于发生在细胞过多、过度增殖、上皮区域中的缺氧和/或代谢物耗尽条件而产生的。 MEC-C在富集缺氧相关基因（如VEGFA和CA9）方面与MEC-D相当，但相比之下细胞密度低，多见于坏死区。
MEC-B 的特征在于与细胞外基质重塑相关的基因，包括 NFKB 组分（NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NFKBIZ）、细胞保护性蛋白酶抑制剂（SERPIN 和 TIMP1）、几丁质酶（CHI3L1、CHI3L2）、金属蛋白酶（MMP7、MMP9）和 细胞外基质基因。 此外，MEC-B 的特点是富含与以趋化因子 CXCL1、CXCL8 (IL8) 和 CCL2 为特征的炎症反应有关的基因。 MEC-B 主要位于中等细胞区域，与 MEC-A 或 MEC-D 相比，残留室管膜分化结构的证据较少。
为了进一步阐明不同 MEC subclusters的生物学，检查了它们的空间关系。 MEC 亚群通常位于具有不同组织形态的相邻组织学区域，支持 MEC 亚群代表间充质分化的离散阶段的假设。 MEC clusters通常以从上皮区向外辐射的连续波的保守顺序排列。这种空间排列暗示了一个空间谱系轨迹，可能代表 EMT 中的阶段，其序列通常从 MEC-A 开始，然后是 MEC-B，最后是 MEC-C。邻近分析表明 MEC-D 和 MEC-A 是分离最远的 MEC subcluster，结合空间上不同的标记基因表达表明 MEC-D 和 MEC-A 代表 PFA 中单独的 EMT 途径。基于组织重塑和较少上皮分化、少细胞和坏死组织学的基因表达特征，假设 MEC-B 和 MEC-C 区代表 EMT 过程的后期阶段。
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Infiltrating myeloid immune cells are spatially related to and interact with specific mesenchymal zone clusters
三个主要的 ST clusters以免疫细胞标记基因表达为特征，这些clusters与其他非肿瘤细胞类型聚集，包括血管内皮和红细胞。最丰富的免疫 ST clusters显示与骨髓 scRNAseq 亚群显著的标记基因重叠，具有经典 M1 极化的基因表达特征。这包括吞噬作用、MHC-II 类和补体激活基因，因此 ST clusters被标记为经典骨髓（经典 M）。相比之下，第二丰富的免疫clusters与具有缺氧反应基因表达特征的骨髓 scRNAseq 亚群重叠。与该 ST clusters相关的基因GO主要与炎症反应相关，主要由与中性粒细胞趋化性有关的趋化因子组成，并被标记为缺氧骨髓 (hypoxia-M)。最小的骨髓 ST cluster，以单核细胞趋化因子 CCL3 和 CCL4 的特别高表达为特征，被标记为骨髓趋化因子（趋化因子-M）。
空间分析揭示了与间充质区相关的经典-M 和缺氧-M 点定位的不同模式。 观察到与大型间充质区接壤的经典 M ST cluster spot的粘性带。 使用带有经典 M 标记 AIF1 (Iba1) 和 MEC 标记 CA9 的 IHC 证实了这种独特的细胞排列，显示坏死区域内有密集的骨髓和 MEC 细胞带。 免疫和肿瘤 ST clusters的邻近分析表明，经典 M 与 MEC-A 最密切相关。 缺氧-M 也与间充质区有关，但与经典-M 相比，它嵌入间充质区域而不是其边界，这表明在 EMT 的后期阶段具有潜在作用，例如清除细胞碎片。
经典-M 与 MEC-A 边界细胞的空间共定位表明在 EMT 启动中具有潜在的免疫作用。通过在体外将 CD14+ 骨髓细胞与 PFA EPN 细胞系 MAF-811 和 MAF-928共培养 3 天，对这一假设进行了功能测试，然后通过 RNAseq 测量转录组变化。与 CD14+ 骨髓细胞共培养的细胞系显示间充质区clusters特征基因显著上调，但上皮区clusters没有。具体而言，观察到两种细胞系中 MEC-A 标记基因（包括 HLA-DRA、C1S、C1R、SERPINA3、CHI3L1）的主要由骨髓介导的上调，而没有观察到 MEC-D 特征基因的显著富集。相比之下，PFA 细胞系（MAF-811 和 MAF-928）和短期培养（PFA-1239）在缺氧条件下（2% O2 下 3 天）的增殖，先前显示上调间充质基因，特别是上调 MEC- D标记基因（包括CA9、LDHA）。这些结果进一步支持了 PFA 中两种不同的 EMT 途径的共存，其中 MEC-A 由骨髓细胞相互作用引发，可能是由正常上皮细胞结构的破坏引起的，而 MEC-D 出现在环境中出现的缺氧条件下肿瘤快速增殖。以前认为缺氧是 EPN 中 EMT 的主要原因，但本研究表明，在肿瘤出现时，骨髓细胞相关的 EMT 明显更广泛，MEC-A 平均占肿瘤体积的 2.6%，而 MEC-D 仅占 1.1%。
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Identification of a novel proliferative progenitor cluster in PFA epithelial zones
ST 上皮区由 6 个主要的 ST clusters组成，它们存在于所有 14 个分析的 PFA 样本中。其中包括与 scRNAseq TEC 亚群相似的 3 个 ST clusters，按丰度顺序标记为 TEC-A、TEC-B 和 TEC-C。尽管 TEC scRNAseq 标记基因高度富集，但分离的 TEC ST clusters位于 Clustree 分支，主要由非肿瘤性 ST clusters组成，并被标记为 TEC-D。出乎意料的是，一个上皮区 ST clusters表达了仅限于 UEC scRNAseq 亚群的基因，特别是 ELN、MFAP2、MDK 和 COL9A2，在GO上与弹性纤维相关。该cluster比间充质区祖细胞亚群 UEC-B 更丰富，因此，该cluster被命名为 UEC-A。 UEC-A 具有与 UEC-B 不同的基因表达谱，并且通过富集核糖体基因表达（FC=60.1，p<0.0001）与其他上皮区clusters区分开来，表明蛋白质合成水平相对较高。邻近分析还表明，UEC-A 和 UEC-B 在空间上相距较远，UEC-A 与上皮区clusters混合，不像 UEC-B 仅限于间充质区。 UEC-A spot通常与分化的上皮特征有关，例如真正的ependymal rosette。
对应于 scRNAseq CEC 亚群的单个 ST clusters（标记为 CEC）相应地富集了与纤毛形成相关的基因，并且通常与ependymal rosettes相关。 在空间上，CEC 倾向于定位在与间充质区相邻的上皮区内。
主要上皮区 ST cluster TEC-A 是在所有 PFA 样本中鉴定的最丰富的cluster，并且与 UEC-A 相似，通常与 PFA 分化的组织学区域相关。 HES6 是一种神经系统发育基因，是 TEC-A 中的顶级标记基因，与之前在 TEC scRNAseq 分析中发现的许多基因一起，包括转运蛋白 VIPR2 和 AQP4。 个别 TEC-B ST cluster spot在分化区域与 TEC-A 混合，但通过表达 CTNNB1、DDX3X 和 LRCC75A 与 TEC-A 区分开来。 TEC-D 与其他 TEC 亚群的区别通常在于低细胞性和相对高的 GFAP 表达。
对细胞周期阶段基因表达的分析表明，上皮区 ST clusters总体上比间充质区或非肿瘤clusters更具增殖性。 所有 ST clusters中增殖最多的是 UEC-A，与核糖体基因表达推断的预测的高蛋白质合成一致。 相比之下，间充质相关的 UEC-B 在 G0 细胞周期阶段具有最高比例的细胞，表明处于静止表型。 使用与有丝分裂标记 Ki-67 相关的 UEC-A 标记 COL9A 和 TEC-A 标记 VIPR2 的 IHC 证实了 UEC-A 的高增殖率，显示 COL9A2 和 Ki-67 在细胞过多区域的共定位。 IHC 还证实上皮区相对于 CA9+ 间充质区的增殖率相对较高。
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Discussion
使用与 scRNAseq 集成的空间转录组学 (ST) 识别和表征间充质和上皮亚群，能够更准确地可视化和绘制 PFA 中肿瘤进展的阶段。 发现具有不同表型的共存祖细胞clusters在空间上仅限于上皮或间充质 TME 生态位，这说明了这一点。 已在人类乳腺癌中发现了在同一原发肿瘤内共存癌症干细胞 (CSC) 的现象 (14)。 本研究绘制了增殖性上皮样 CSC 和静止间充质样 CSC，在本研究中显示出与 PFA 中的祖细胞表型显著的分子和空间相似性。 我们认为双 PFA 祖细胞群通过 EMT 整体参与细胞可塑性。 将 UEC-A 鉴定为高度增殖的祖细胞为 PFA 的治疗开发提供了新的靶点
ST 提供的分辨率提高还揭示了 TME 中存在两条独立的 EMT 途径——一条与骨髓细胞相互作用有关，另一条由缺氧诱导。癌症中的 EMT 阶段以前曾使用转基因小鼠模型，结合谱系追踪、流式细胞术、多色免疫荧光和 scRNAseq 进行表征。在这里，我们使用 ST 提供了一种正交方法，用于在本土肿瘤中原位描绘 EMT 阶段。需要进一步的工作来确定间充质细胞作为一个整体或不同的 EMT 轨迹是否有助于 EPN 的侵袭性表型。这是一个关键的临床相关问题，因为 EPN 的高复发率归因于在全切除和放射治疗后仍然存在的微观疾病，并且这可能与 EMT 的侵入性方面有关。这种假设的 EMT 相关侵袭性不仅可以解释复发，还可以解释标准治疗方法通常失败的复发性 EPN 儿童所经历的可怕临床结果。
PFA 中的骨髓相关 EMT 是一种炎症过程，可能由稳态扰动触发，例如结构破坏（结构丧失是上皮组织的炎症事件）或缺氧，或者由识别肿瘤相关抗原驱动的抗肿瘤反应。 鉴于 PFA 室管膜瘤的突变负担低于触发强大的肿瘤抗原驱动的抗肿瘤免疫反应所必需的阈值，因此不太可能发生抗肿瘤免疫过程。 为了支持稳态作用，PFA 中间充质区周围的髓细胞聚集与脊髓损伤中发现的髓细胞聚集非常相似，这形成了保护周围“健康”组织免受炎症稳态重塑的屏障
因此，在 PFA 中，宿主免疫系统可能将肿瘤视为自身，从而启动潜在的致瘤修复过程。事实上，ST 揭示的集体空间细胞和分子见解表明 PFA 室管膜瘤是一种“不会愈合的伤口”。先前已经提出伤口愈合和肿瘤发生之间的相似性，但很难证明。伤口愈合过程包括 3 个主要阶段：(i) 炎症阶段，(ii) 上皮再生的再生阶段，和 (iii) 最终消退阶段。我们目前的研究已经确定了反映初始炎症阶段的 PFA 过程和再生阶段固有的组织重塑要素。伤口愈合的再生阶段还包括再上皮化，这是通过空间分离的迁移和增殖上皮区域的活动来实现的。在正常皮肤中，重新上皮化涉及未受损的近端上皮层，由更多分化的上皮细胞组成，集体前进以重新填充受损区域。这个过程是由上皮干细胞重新填充的上皮细胞的远端增殖池驱动的。在 PFA 中，我们假设 UEC-A 反映了这种远端增殖性上皮祖细胞亚群。我们的数据表明上皮和间充质区域之间存在相互作用循环，由此缓慢循环的间充质细胞（由于各种细胞应激而由上皮细胞产生）通过激活和增殖上皮细胞增殖池发送信号使肿瘤重新上皮化.这驱动更多分化的上皮区细胞使肿瘤“重新上皮化”，这可能由 CEC 与间充质区相邻的频繁聚集表明。由于肿瘤从未达到伤口愈合的最终消退阶段，炎症和再上皮化的循环持续存在，导致肿瘤进展不受控制。测试 PFA 中假设的 EMT 驱动的上皮再形成的调查可能会揭示新的治疗干预措施。
The concept of a “wound that will not heal” in PFA is may also apply to histologically related supratentorial EPNs which are predominantly caused by a ZFTA-RELA gene fusion. This fusion results in constitutive activation of RELA, a key component of the NFKB pathway, a critical controller of inflammation and tissue remodeling programs. Thus, persistently dysregulated inflammation and tissue remodeling-driven by the ZFTA-RELA fusion in supratentorial EPN represents a phenocopy of PFA, suggesting that a common process of unresolved wound healing drives progression in the majority of EPN tumors.
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