Identification and validation of key molecules associated with humoral immune modulation in Parkinson's disease based on bioinformatics
基于生物信息学的帕金森病体液免疫调节相关关键分子的鉴定和验证
发表期刊：Front Immunol
发表日期：2022 Sep 15
影响因子：8.786
DOI: 10.3389/fimmu.2022.948615
一、研究背景
随着医学发展的进步，人们的预期寿命大大增加；特别是随着老龄化程度的增加，与年龄相关的神经退行性疾病的发病率也随之提高。帕金森病（PD）是最常见的神经退行性运动障碍，其发病年龄通常在65-70岁之间。
神经免疫性炎症可以保护神经元免受损害，但其毒性作用也会加剧神经元的紊乱，这主要是由细胞因子和趋化因子调节的中枢神经系统（CNS）的先天免疫细胞和外周侵入性免疫细胞引起的。神经退行性疾病中血脑屏障（BBB）的破坏使血液中的神经毒性物质、细胞和微生物病原体进入大脑，这些与炎症和免疫反应有关，可以启动各种神经退行性疾病的途径。炎症性中枢神经系统细胞表达某些粘性分子，吸引更多的外周免疫细胞和抗体通过BBB进入中枢神经系统。
二、材料与方法
1、数据来源
1） 基因表达数据GSE100054（10个PD和9个HC）和GSE49126（30个PD和20个HC）
2） GSE22491（10个PD和8个HC）被用来作为验证数据集
3） 从三位神经退行性疾病专家那里招募了69名PD患者，以及36名年龄和性别匹配的健康对照者
2、分析流程
1） 差异表达基因的鉴定：limma，采用线性模型来评估PD患者和健康对照组之间的差异表达；所有的DEGs与疾病数据库DisGeNET中记录的与帕金森病相关的基因相交，得到感兴趣的DEGs
2） PPI网络的构建和模块分析：蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）是用STRING构建的
3） DEGs和重要模块的KEGG和GO富集度分析：Fisher's精确检验对GO分类进行评估，使用关键词 "免疫"，确定了39条参与免疫相关生物过程的途径，共获得13个分子
4） 对PD分子特征的验证：在数据集GSE22491中，比较了PD患者和健康对照组中13个分子的表达水平；选择PPBP、PROS1和LCN2三个分子进行实验验证
5） PBMC分离、RNA提取和反转录、定量实时聚合酶链反应、酶联免疫吸附试验
流程图
三、实验结果
01 - 识别差异表达的基因
作者从GEO数据库下载了微阵列表达数据集。根据上述选择标准进行差异表达分析后，在GSE100054中得到373个DEGs，包括337个上调基因和36个下调基因，在GSE49126中得到384个DEGs，包括200个上调基因和184个下调基因。进行主成分分析（PCA）并以散点图显示，其中每个点代表一个样本（图2A，C），在火山图中以不同颜色显示筛选出的组间差异明显的基因（图2B，D）。用GSE100054和GSE49126来识别不同表达的基因（DEGs），然后分别与DisGeNET数据库记录的PD相关基因相交（图3A）。
图2 基因芯片的PCA图和不同表达基因的火山图
为了描述差异表达基因所编码的蛋白质之间的相互作用，从STRING数据库中构建了一个PPI网络（图3B）。该网络由92个节点和293条边组成；节点代表感兴趣的DEGs，边代表基因之间的相互作用。然后将PPI网络导入cytoscape进行可视化，并使用MCODE进行聚类相关分析。最后，得到三个高分的聚类，即聚类1（17个节点，得分8.7，图3C）、聚类2（7个节点，得分4.3，图3D）和聚类3（3个节点，得分3.0，图3E）。
图3 蛋白质-蛋白质相互作用网络和关键蛋白质表达模块
02 - DEGs的功能富集和重要模块
基于智人背景的clusterProfiler软件包对感兴趣的DEGs（94个基因）和Hubgenes（27个基因）进行了富集分析，以获得富集信息。通过GO分类和富集分析，如生物过程、细胞成分、分子功能等，揭示了与PD相关的功能注释词，并探讨了其生物学意义。为了揭示与感兴趣的DEGs和Hubgenes相关的生物学途径，利用KEGG数据库获得了重要的信号通路。
DEGs富集的生物学过程主要包括炎症反应的调节、血小板脱颗粒、免疫效应过程的调节、免疫反应分子介质的产生、白细胞增殖、参与免疫反应的细胞因子产生、神经炎症反应等（图4A）。在 "细胞成分"方面，DEGs主要富集在囊泡腔、血小板α颗粒腔、质膜外侧、运输囊泡等区域（图4B）；在 "分子功能"方面，DEGs主要与细胞因子活性、受体配体活性、NAD+核苷酶活性、白介素-1受体结合等有关（图4C）。在KEGG的富集分析中，DEGs主要涉及脂质和动脉硬化、MAPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、HIF-1信号通路、炎症性肠病和胆固醇代谢等（图4D）。
图4 DEGs的GO和KEGG分析结果
Hubgenes富集的生物过程主要包括参与免疫反应的细胞因子产生、炎症反应的调节、血小板脱颗粒、胶质细胞激活、细胞因子产生的正向调节、免疫效应过程的调节等（图5A）。在 "细胞成分"方面，Hubgenes主要富集在囊泡腔、分泌颗粒腔、膜区和其他区域（图5B）。在 "分子功能"方面，表明Hubgenes主要与细胞因子活性、细胞因子受体结合、淀粉样蛋白-β结合、C-C趋化因子受体活性等有关（图5C）。在KEGG的富集分析中，Hubgenes主要涉及类风湿性关节炎、细胞因子-细胞因子受体相互作用、癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、坏死、糖尿病并发症的AGE信号通路等（图5D）。
图5 Hubgenes的GO和KEGG分析结果
03 - 鉴定和验证PD的分子特征
作者基于27个Hubgenes（以 "免疫 "为关键词）进行了基因本体论（GO）的生物过程分析，筛选出39条免疫相关的通路，并从上述Hubgenes中选出13个靶分子，如CCR2、CD 44、TLR2、TLR4、IL4、IL-1B、IL-33、TGFB2、PPBP、PROS1、CLU、LCN2和NLRP3。GSE22491被选为验证数据集以比较这些分子在PD和HC中的表达水平。IL-1B、TGFB2、CLU、IL33和NLRP3的表达在两组之间没有明显差异；其他基因被认为有明显差异（图6）。根据以往的研究和实验实施的客观条件，选择了PPBP、LCN2和PROS1进行以下实验。与HC相比，这三个分子在PD中都有所下降（图6）；但在GSE100054中，PPBP、PROS1和LCN2的表达水平高于HC（图7A-C）。在免疫相关的生物过程中，PPBP和LCN2主要参与体液免疫反应和中性粒细胞激活参与免疫反应；然而，除了体液免疫反应，PROS1也参与调节体液免疫反应和免疫效应器过程。
图6 GSE22491中13个基因的表达水平
图7 GSE100054中PD患者和健康对照的PPBP、PROS1和LCN2的表达水平
04 - 在转录水平上对选定的差异分子进行验证
作者招募了69名PD患者（39名男性和30名女性）和36名健康对照（19名男性和17名女性）。从这些参与者中，首先，选择了一些进行mRNA表达水平分析。观察到，与健康对照组相比，PD患者的PBMC中LCN2的表达明显增加；但是，PPBP的mRNA水平下降（图8B，C）。PROS1的表达水平相当低，因此无法评估。此外，还从全血中提取了RNA，PROS1的表达在PD中明显增加（图8A），而LCN2和PPBP在组间没有明显差异。
图8 PD患者和健康对照组的PROS1、PPBP和LCN2表达情况
05 - 在翻译水平上对选定的差异分子进行验证
对于ELISA，上述三个分子的血浆水平与mRNA表达一致。研究结果显示，PD患者和健康对照组的外周血样本中PPBP水平分别为1.770微克/毫升和2.269微克/毫升（图9A）。与健康对照组相比，检测结果显示，PD患者血浆中PROS1和LCN2的浓度均有所提高（图9B, C）。应用接收操作特征（ROC）曲线来确定上述三种分子的诊断效果，发现PPBP、PROS1和LCN2的曲线下面积（AUC）分别为0.663、0.674和0.885（图10A-C）。
图9 PD患者和健康对照组的PPBP、PROS1和LCN2的血浆水平
图10 PPBP、ROS1和LCN2的ROC曲线
四、结论
在这项研究中，作者利用基因表达数据集来识别DEGs，并通过构建PPI网络和识别关键模块发现了13个感兴趣的基因。基于GO生物过程分析，PPBP、PROS1和LCN2参与了体液免疫反应。尽管用Q-PCR和ELISA方法证明了PPBP、PROS1和LCN2在帕金森病患者和健康对照组中的统计学差异，但还需要进一步的调查，以便更深入地了解涉及这三种分子的外周体液免疫反应对帕金森病潜在机制的影响。
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