写在前面
本次分享一篇2020年由金海翎老师发表在Science上的paper“Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogen to silence virulence genes”。主要讲了植物在面临真菌病害灰霉病时，会通过外泌体途径分泌小RNA来靶向灰霉病菌的毒性基因来抵抗病原菌的入侵。文章结论让人通俗易懂(可能哺乳系统中人们已经接受了这种现象)，新意主要在于思路和采取的技术方面，
Abstract
病原菌和害虫会传递小RNA来抑制宿主免疫反应。与之对应的是，宿主会分泌小RNA到病原菌中来抑制其毒性，而目前对于宿主的小RNA是如何转运的还未知。作者展示了拟南芥通过外泌体途径分泌囊泡裹挟小RNA到灰霉病菌中，囊泡在侵染点积累并且被病菌占据，沉默了灰霉病菌中的毒性基因。
Introduction
在动物体内，sRNAs可以通过细胞外囊泡、特异跨膜蛋白、高密度脂蛋白复合物或缝隙连接运输。植物中，sRNAs可能通过胞间连丝和维管系统。但是植物中，sRNAs在植物与病原菌互作中是如何传递的还是个未知的问题。
Results
1. Plant endogenous sRNAs are transferred into fungal cells via extracellular vesicles
为了查明宿主sRNAs如果向病原菌中传递，并且鉴定植物内源的sRNAs，作者采用拟南芥-灰霉病菌系统来展示跨界sRNAs运输。因为植物和真菌的细胞壁成分不同，他们采用连续的原生质体纯化体系来从侵染部位分离真菌细胞。
通过对灰霉菌原生质体的sRNAs测序得到42个拟南芥的sRNAs，使用叶片的总sRNAs作为对照。在这42个sRNAs中，有25个是低丰度的，并不在总sRNAs的top100中，展示出sRNAs运输的选择性。这些结果通过sRNAs的RT-PCR得到验证(F1A)。这就暗示，传递sRNAs到真菌细胞中并不是简单通过剂量效应，可能有个选择性的过程。
动物中，胞外囊泡介导了运输过程。我们从侵染叶片的质外体空间分离了sRNAs，结果发现，TAS1c-siR483, TAS2-siR453, 和 IGN-siR1 比TAS1c-siR585, TAS2-siR710,
和 IGN-siR107积累水平要高(F1B)，这与真菌原生质体的结果是相似的。42个传递的sRNAs中，有31个出现在囊泡库中。核酸酶保护试验发现，传递的sRNAs被囊泡保护免受核酸酶降解，除非囊泡被Triton-X100破坏(F1C)。这就说明sRNAs被囊泡包裹运输，而不是裸漏在表面。
F1 Plant endogenous sRNAs are transferred into fungal cells via extracellular vesicles.png
2. Tetraspanin-associated exosomes are responsible for transferring plant sRNAs to fungal cells.
动物细胞外囊泡根据其特定的蛋白标记物和来源可分为外泌体、脱落微囊泡和凋亡小体，并且动物细胞能通过外泌体完成和其寄生菌的相互转运，因此作者就首先尝试外泌体途径。动物中外泌体的marker基因为四分子交联体家族成员，如CD63，植物中的TET8和TET9在灰霉病侵染时被诱导表达，TET8和TET9与CD63展示出结构相似性。
TET8在真菌侵染点积累(F2A)，动物细胞中外泌体来自于多泡小体(MVBs)，拟南芥中MVB marker是ARA6(GTPase)。ARA6也在侵染点富集，揭示TET8联系的 囊泡来自于ARA6。投射电镜下观察，MVBs整合细胞膜在侵染点释放囊泡(F2B)。ARA6-GFP和TET8-GFP在侵染点的囊泡聚集发现，后者有更多的囊泡分泌，因此TET8标记的胞外囊泡作为植物的外泌体。
体外分离侵染TET8-GFP的灰霉病菌，TET8-GFP能在真菌细胞中检测的到，使用Triton-X100处理后也能检测的到(F2C)。这就说明真菌细胞会被植物外泌体所占据，并且也能检测到外泌体携带的sRNAs(F2D)。这也就说明植物分泌携带sRNAs的外泌体到真菌细胞中。
F2 Tetraspanin-associated exosomes are responsible for transferring plant sRNAs to fungal cells.png
3. TET8 and TET9 coordinately regulate sRNA secretion and host immunity
TET8-CFP和TET9-YFP在侵染点共定位(F3A)，Co-IP验证其也是互作的。并且tet8/tet9双突变体展示出更感病的表型(F3B)，并且在双突变体中，转移到真菌细胞的sRNAs是减少的(F3C)。这也就说明，TET8和TET9联系的外泌体通过传递sRNAs到真菌细胞中来阻断真菌侵染。
F3.TET8 and TET9 coordinately regulate sRNA secretion and host immunity.png
4. Transferred host sRNAs silence fungal virulence genes and suppress fungal pathogenicity.
使用sRNAs合成的突变体，dcl2/3/4（破坏了tasiRNA的产成），rdr6（破坏了tasiRNA的形成），这些突变体展示出更感病的表型(F4AB)，这说明sRNAs能抑制病原菌的侵染。我们猜测sRNAs会靶向灰霉菌的毒性基因，通过预测发现拟南芥囊泡中的sRNAs靶向灰霉菌囊泡运输途径的基因，并且这些预测的靶基因在侵染后是下调的，但在dcl2/3/4和rdr6突变体中并不下调(F4C)。真菌的AGO蛋白有核糖核酸酶活性，能够切割sRNAs的靶基因，作者在被侵染的组织中检测到被切割的靶基因，这就说明植物sRNAs沉默真菌的靶基因通过mRNA切割的方式。
在真菌中沉默囊泡运输的基因，再接种发现，灰霉菌的致病力下降，因此说明囊泡运输的基因对灰霉菌的致病力很重要。在拟南芥中过表达囊泡运输的sRNAs发现增强了拟南芥对灰霉菌的抗性，并且相应灰霉菌的靶基因也下调。这就说明跨界的sRNAs增强宿主抗性是通过沉默真菌基因。
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后记
生物是个整体，不同物种及模式系统可以相互借鉴。
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