1. clinvar
- clinvar是一个开放的数据库，每个研究机构都可以向其提交数据，对于提交的信息，会有专家团队进行审核评级。对于数据库中的位点，根据注释信息的可靠性，分成了1到4个不同的星级，星级越高，可信度越高。
- 安装
perl annotate_variation.pl --downdb --buildver hg19 -downdb -webfrom annovar clinvar_20180603 ./
- 下载之后，得到一些注释信息，其中ANNOVAR包含5个注释信息CLNALLELEID， CLNDN， CLNDISDB， CLNREVSTAT， CLNSIG：
ALLELEID ="the ClinVar Allele ID"
CLNDN ="ClinVar's preferred disease name for the concept specified by disease identifiers in CLNDISDB"
CLNDNINCL ="For included Variant : ClinVar's preferred disease name for the concept specified by disease identifiers in CLNDISDB"
CLNDISDB ="Tag-value pairs of disease database name and identifier, e.g. OMIM:NNNNNN"
CLNDISDBINCL ="For included Variant: Tag-value pairs of disease database name and identifier, e.g. OMIM:NNNNNN"
CLNHGVS ="Top-level (primary assembly, alt, or patch) HGVS expression."
CLNREVSTAT ="ClinVar review status for the Variation ID"
CLNSIG ="Clinical significance for this single variant"
2. ANNOVAR注释结果中各列的表头说明：
| ID | 详解 |
|---|---|
| Chr | 染色体 |
| Start | 变异位点在染色体上的起始位置 |
| End | 变异位点在染色体上的结束位置 |
| Ref | 参考基因组碱基型 |
| Alt | 变异碱基型 |
| Func.refGene | 对变异位点所在的区域进行注释（exonic, splicing, UTR5, UTR3, intronic, ncRNA_exonic, ncRNA_intronic, ncRNA_UTR3, ncRNA_UTR5, ncRNA _splicing, upstream, downstream, intergenic） |
| Gene.refGene | 列出该变异位点相关的转录本（只有功能符合 Func 列的转录本才列出）。如果 Func 为intergenic，此处列出两侧的基因名 |
| GeneDetail.refGene | 描述 UTR、splicing、ncRNA_splicing 或 intergenic 区域的变异情况。当 Func 列的值为exonic、ncRNA_exonic、intronic、ncRNA_intronic、upstream、downstream、upstream;downstream、ncRNA_UTR3、ncRNA_UTR5 时，该列为空；当 Func 列的值为 intergenic 时，该列格式为dist=1366;dist=22344，表示该变异位点距离两侧基因的距离 |
| ExonicFunc.refGene | 外显子区的 SNV or InDel 变异类型（SNV 的变异类型包括 synonymous_SNV, missense_SNV, stopgain_SNV, stopgloss_SNV 和 unknown；Indel 的变异类型包括 frameshift insertion, frameshift deletion, stopgain, stoploss, nonframeshift insertion, nonframeshift deletion 和 unknown） |
| AAChange.refGene | 氨基酸改变，只有当 Func 列为 exonic 或 exonic;splicing 时，该列才有结果。按照每个转录本进行注释（例如，NADK:NM_001198995:exon10:c.1240_1241insAGG:p.G414delinsEG，其中，NADK 表示该变异所在的基因名称，NM_001198995 表示该变异所在的转录本 ID，exon10 表示该变异位于转录本的第 10 个外显子上，c.1240_1241insAGG 表示该变异引起 cDNA 在第 1240 和 1241 位之间插入 AGG，p.G414delinsEG 表示该变异引起蛋白序列在第 414 位上的氨基酸由 Gly 变为 Gly-Glu。再如， FMN2:NM_020066:exon1:c.160_162del:p.54_54del，表示该变异引起 cDNA 的第 160 到 162 位发生删除，p.54_54del 表示该变异引起蛋白序列在第 54 位上的氨基酸删除） |
| cytoBand | 该变异位点所处的染色体区段（利用 Giemas 染色观察得到的） |
| genomicSuperDups | 基因组中的重复片段 |
| nci60 | NCI-60 human tumor cell line panel exome sequencing allele frequency data |
| esp6500siv2_all | 国家心肺和血液研究所外显子组测序计划（NHLBI-ESP project，esp6500si_all 数据库中包含SNP 变异、Indel 变异和Y 染色体上的变异）的所有个体中，突变碱基的等位基因频率（alternative allele frequency）。 |
| ALL.sites.2015_08 | 给出千人基因组计划数据（2015 年 8 月公布的版本）的所有人群中，该变异位点上突变碱基的等位基因频率 |
| EAS.sites.2015_08 | 给出千人基因组计划数据（2015 年 8 月公布的版本）的亚洲人群中，该变异位点上突变碱基的等位基因频率 |
| SAS.sites.2015_08 | 给出千人基因组计划数据（2015 年 8 月公布的版本）的南亚洲人群中，该变异位点上突变碱基的等位基因频率 |
| avsnp150 | 该变异在 dbSNP中的 ID |
| SIFT_score | SIFT 分值，表示该变异对蛋白序列的影响，SIFT 分值越小越“有害”，表明该 SNP 导致蛋白结构或功能改变的可能性大； |
| SIFT_pred | D: Deleterious (sift<=0.05); T: tolerated (sift>0.05)） |
| Polyphen2_HDIV_score | 利用 PolyPhen2 基于 HumanDiv 数据库预测该变异对蛋白序列的影响，用于复杂疾病，数值越大越“有害”，表明该 SNP 导致蛋白结构或功能改变的可能性大；damaging (0.453<=pp2_hdiv<=0.956); B: benign (pp2_hdiv<=0.452)） |
| Polyphen2_HDIV_pred | D 或 P 或 B（D: Probably damaging (>=0.957), P: possibly |
| Polyphen2_HVAR_score | 利用 PolyPhen2 基于 HumanVar 数据库预测该变异对蛋白序列的影响，用于单基因遗传病。数值越大越“有害”，表明该 SNP 导致蛋白结构或功能改变的可能性大； |
| Polyphen2_HVAR_pred | D 或 P 或 B（D: Probably damaging (>=0.909), P: possibly damaging (0.447<=pp2_hvar<=0.909); B: benign (pp2_hvar<=0.446)） |
| LRT_score | LRT 分值，表示该变异对蛋白序列的影响，值越大越“有害”，表明该 SNP 导致蛋白结构或功能改变的可能性大。 |
| LRT_pred | D、N 或者 U(D: Deleterious; N: Neutral; U: Unknown)。 |
| MutationTaster_score | MutationTaster 分值，表示该变异对蛋白序列的影响，值越大越“有害”，表明该 SNP 导致蛋白结构或功能改变的可能性大。("polymorphism_automatic" |
| MutationTaster_pred | A ("disease_causing_automatic"); "D" ("disease_causing");"N" ("polymorphism"); "P" |
| MutationAssessor_score | MutationAssessor预测的致病得分 |
| MutationAssessor_pred | MutationAssessor根据阈值判断得到的预测分类：H为较高可信度的致病位点，M为中等可信的致病位点，L为低可信度的致病位点，N为无害位点 |
| FATHMM_score | FATHMM软件预测的致病性得分 |
| FATHMM_pred | FATHMM根据阈值得到的分类：D为较高可信度的致病位点，P为可信度一般的致病位点 |
| RadialSVM_score | higher score denoting more deleterious variants |
| RadialSVM_pred | D: Deleterious; T: Tolerated |
| LR_score | higher score denoting more deleterious variants |
| LR_pred | D: Deleterious; T: Tolerated |
| VEST3_score | Variant effect scoring tool；Random forest classifier， higher values are more deleterious |
| CADD_raw | CADD raw score |
| CADD_phred | CADD phred-like score，higher values are more deleterious |
| GERP++_RS | GREP++ "rejected substitutions" (RS) score，higher scores are more deleterious |
| phyloP46way_placental | higher scores are more deleterious |
| phyloP100way_vertebrate | higher scores are more deleterious |
| SiPhy_29way_logOdds | higher scores are more deleterious |
| dgvMerged | 人类结构变异注释结果：http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home |
| phastConsElements100way | 由 phastCons 程序基于脊椎动物全基因组比对预测得到的保守区域，100way 是指使用的物种数目为 100 个 |
| omim_201806 | 孟德尔遗传病数据库注释 |
| cosmic70 | 人类癌症体细胞突变影响的数据库，COSM开头为ID可到网站查询https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic |
| CLNALLELEID | the ClinVar Allele ID |
| CLNDN | ClinVar's preferred disease name for the concept specified by disease identifiers in CLNDISDB |
| CLNDISDB | Tag-value pairs of disease database name and identifier, e.g. OMIM:NNNNNN |
| CLNREVSTAT | ClinVar review status for the Variation ID |
| CLNSIG | Clinical significance for this single variant |
| gwasCatalog | 检测变异位点是否在以往的 GWAS 研究中被报导，表示该变异位点与哪些疾病相关联，“.”表示没有 GWAS 报导 |
| HGMD | HGMD注释结果 |
| Allele_frequency | 样品变异碱基的等位基因频率 |
| QUAL | 变异的质量值 |
| FORMAT | 通常为：GT:AD:DP:GQ:PL，标记样品列属性 |
| sample | 样品信息列详情见：http://www.omicsclass.com/article/6 |
详见 https://brb.nci.nih.gov/seqtools/colexpanno.html
3. 注释流程
vcf 先转成annovar file
perl convert2annovar.pl -format vcf4 cohort.vcf > cohort.avinput
# 多样本合并后的vcf
perl /Users/chengkai/Documents/05_software/annovar/annovar/convert2annovar.pl -format vcf4 -allsample -withfreq cohort.filter.vcf > cohort.filter.avinput
- ANNOVAR支持三种不同形式的注释： gene-based，region-based 和filter-based。这三种注释分别针对于每一个variant的不同方面：
1.基于基因的注释（gene-based annotation）揭示variant与已知基因直接的关系以及对其产生的功能性影响。
2.基于区域的注释（region-based annotation）揭示variant 与不同基因组特定段的关系，例如：它是否落在已知的保守基因组区域。
3.基于过滤子的注释（ filter-based annotation）则给出这个variant的一系列信息，如： population frequency in different populations 和various types of variant-deleteriousness prediction scores，这些可被用来过滤掉一些公共的及 probably（大概，肯定的成分较大,，是most likely）nondeleterious variants。
perl table_annovar.pl <variant.vcf> humandb/ --outfile final --buildver hg19 --protocol
refGene,cytoBand,1000g2014oct_eur,1000g2014oct_afr,exac03,ljb26_all,clinvar_20140929,snp138
--operation g,r,f,f,f,f,f,f --vcfinput
perl /Users/chengkai/Documents/05_software/annovar/annovar/table_annovar.pl cohort.filter.avinput /Users/chengkai/Documents/05_software/annovar/annovar/humandb/ -buildver hg19 -out cohort -remove -protocol refGene,cytoBand,esp6500siv2_all,1000g2015aug_all,1000g2015aug_eas,exac03,avsnp147,dbscsnv11,clinvar_20180603,intervar_20170202,icgc21,dbnsfp33a,gnomad_exome -operation g,r,f,f,f,f,f,f,f,f,f,f,f -nastring . -polish
- <variant.vcf> 参考（refers to）输入的vcf文件的名称。 ‘--protocol’ 选项后跟注释来源数据库的准确名称。 ‘--operation’ 选项后跟注释的类型： ‘g’ 表示基于基因的注释（gene-based annotation）、‘r’ 表示基于区域的注释（region-based annotation） 、‘f’ 表示基于筛选子的注释（filter-based annotation）。‘--outfile’ 选项是指定输出文件的前缀 。
4. 常用注释数据库下载
- 注释文件在ANNOVER分For gene-based annotation和For filter-based annotation以列表的形式详细介绍，链接
perl annotate_variation.pl –downdb –webfrom annovar –buildver hg19 refGene humandb/
perl annotate_variation.pl –downdb –webfrom annovar –buildver hg19 1000g2015aug humandb/
perl annotate_variation.pl –downdb –webfrom annovar –buildver hg19 exac03 humandb/
perl annotate_variation.pl –downdb –webfrom annovar –buildver hg19 clinvar_20170905 humandb/
perl annotate_variation.pl –downdb –webfrom annovar –buildver hg19 avsnp150 humandb/
perl annotate_variation.pl –downdb –webfrom annovar –buildver hg19 cosmic70 humandb/
perl annotate_variation.pl –downdb –webfrom annovar –buildver hg19 icgc21 humandb/
perl annotate_variation.pl –downdb –webfrom annovar –buildver hg19 nci60 humandb/
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