热应激(Heat stress, HS)严重影响母猪泌乳性能，然而，关于HS通过下丘脑-垂体-乳腺轴(HPMA)影响雌性动物泌乳性能的机制，信息有限。长链非编码RNA (Long non-coding RNAs, lncRNAs)在转录和转录后调控中发挥重要作用。但是，lncRNA在母猪下丘脑-垂体-乳腺轴上表达影响泌乳性能的机制尚不清楚。因此，本研究对热应激和热舒适条件下哺乳母猪的下丘脑、垂体和乳腺组织进行了RNA测序和生物信息学分析，结合转录组分析揭示HPMA对HS的响应机制，探讨热应激诱导哺乳期母猪泌乳的深层次原因。
技术路线
研究结果
HPMA（下丘脑-垂体-乳腺轴）中的鉴定表达分析
使用|log2Fold Change| > 1和Pvalue <0.05作为差异基因筛选标准，分别在不同处理下的下丘脑、垂体和乳腺，鉴定到差异表达的mRNA和lncRNA，并通过venn图，展示下丘脑、垂体和乳腺在热应激下共有的差异表达基因(图1)。聚类分析确定HS和TC条件下DE lncRNA和DE mRNA的表达模式，DE LncRNA和DE mRNA的热图显示三个组织中TC组和HS组分别明显分离(图2)。
图1 HS组和TC组之间HPMA中的DE lncRNA（图1 A）和DE mRNA（图1 B）
图2 HS组和TC组之间HPMA组织中DE lncRNA（图A）和DE mRNA（图B）的热图
本研究主要从激素基因、乳蛋白相关基因和热休克蛋白3个方面对HPMA调控母猪泌乳过程的可能途径进行研究。激素基因方面，HS组下丘脑GHRH、泌乳素释放激素(PRLH)、PRL受体(PRLR)表达显著下调(P < 0.01)。垂体PRL和卵泡刺激素受体(FSHR)的表达下调(P < 0.01)，而GH的表达不受影响。HS组乳腺GH受体(GHR)表达显著上调(P < 0.01)， IGF-1表达显著下调(P < 0.01)。此外，Csn2表达上调(P < 0.05)，Csnk1g3表达下调(P < 0.01)，而Csn1s1、Csn3等乳蛋白相关基因在乳腺中的表达在两组间无显著差异。通过RNA测序，分别在垂体和乳腺中发现编码热休克蛋白的19和25个DE mRNA，包括编码Hsp10、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp110的基因。HS组Hsp90aa1、Hspa4l、Hspa4等大部分基因表达显著上调(P <0.01)。
富集分析
在下丘脑、垂体和乳腺中差异表达的lncRNA，分别预测到129、33和33个潜在的顺式靶基因，对这些靶基因进行GO和KEGG富集分析（图3）。同时，对差异表达的mRNA也分别进行了GO和KEGG富集分析。
图3 (A-B)下丘脑DE lncRNA靶基因的GO和KEGG富集分析;(C-D)垂体DE lncRNA靶基因的GO和KEGG富集分析; (E-F)乳腺DE lncRNA靶基因的GO和KEGG富集分析
lncRNA-mRNA共表达网络的构建
通过构建基因共表达网络，鉴定DE lncRNA与DE mRNA之间的相互作用。下丘脑中只有两个DE lncRNAs (MSTRG.16623.2, ENSSSCT00000057567)与mRNA (ENSSSCG00000003650, ENSSSCG00000034396)呈负相关。垂体和乳腺中DE lncRNAs和DE mRNA的相关性分别为60对和86对，其中50对和72对为正相关，10对和14对为负相关(图4)。在垂体和乳腺中分别有10和6个DE mRNA与不止一个DE lncRNA相互作用。其中，在乳腺中mRNA (ENSSSCG00000008954)与8种不同DE lncRNA呈显著正相关。
图4 lncRNA与mRNA在垂体（图4 A）和乳腺（图4 B）的共表达网络；红色代表上调，绿色代表下调
qPCR验证
从下丘脑、垂体和乳腺中随机选取3个DE lncRNA和3个DE mRNA进行qPCR，验证其差异表达(图5)，结果与测序数据一致。
图5分别为下丘脑、垂体和乳腺DE lncRNA和DE mRNA的qPCR验证结果
结论
本研究采用RNA-seq对HS泌乳母猪的下丘脑、垂体和乳腺组织进行分析，发现各组织大规模的转录变化参与了对HS的适应性反应。HS可降低下丘脑功能及相关激素(GHRH、PRLH、PRL)的表达，并可激活POA的热敏神经元，影响采食量。母猪的垂体在HS期间处于高能量消耗状态，可能导致垂体能量平衡负，内分泌紊乱。此外，HS在哺乳过程中可能导致乳腺缺氧，影响细胞存活，增加细胞间紧密连接的通透性。HS影响Hsps在hpma相关组织中的表达，可能消耗能量储备，降低泌乳性能。结果提示，lncRNA MSTRG.17186、lncRNA MSTRG.5366、CITED4和ROBO1可能是热应激母猪泌乳过程的重要调控因子。需要进一步研究lncRNA与HS下泌乳调控的分子机制。
本研究的RNA测序和分析由上海派森诺生物科技有限公司完成
参考文献：Ni Y, Wu F, Chen Q, Cai J, Hu J, Shen J, Zhang J. Long noncoding RNA and mRNA profiling of hypothalamic-pituitary-mammary gland axis in lactating sows under heat stress. Genomics. 2020 Sep;112(5):3668-3676. doi: 10.1016/j.ygeno.2020.04.021.
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