细胞培养基础知识详解-细胞的复苏、传代和冻存

细胞培养，看似简单的一个实验，却不知道把多少英雄豪杰折磨的意欲“自挂东南枝”~今天科研小助手就为大家盘点一下细胞复苏、传代到冻存的一些步骤和注意事项，希望广大科研汪能与细胞愉快的玩耍！

细胞复苏

细胞复苏的原则－快速融化：
必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

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具体操作：

一. 实验前准备：
1. 将水浴锅预热至37℃。
2. 用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
3. 完全培养液：DMEM高糖＋10% FBS＋1% P/S（培养Siha、Hela）。
4. 在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、枪头、培养瓶等等。

二．细胞复苏培养：
1. 根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。
2. 迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
3. 约1-2 min后冻存管内液体完全溶解（一般细胞冻存量为1ml），将细胞悬液转移到装有约10ml已预热的含血清完全培养液离心管中（目的：稀释去除冻存液中的DMSO），取出放入离心机中以1000 rpm/min速度离心3~5 min。
4. 用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。吸弃上清液，向离心管内加入1 ml培养液，吹打制成细胞悬液。
5. 将细胞悬液分装入培养瓶或者培养皿内，将培养瓶/培养皿放入37℃，5％ CO₂的培养箱内过夜后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。

初学者易犯错误：
1. 水浴锅未预热或者未预热到37℃。
2. 水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
3. 离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
4. 一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

细胞传代

具体操作：

一. 传代前准备：
1. 预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶(Gibco 胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红)的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
2. 用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
3. 正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
4. 点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

二、细胞传代：

1. 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
2. 从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
3. 将培养瓶放入超净工作台后打开瓶口，同时要在酒精灯上烧口消毒。
4. 加入消化液：小心吸出旧培养液（不要直接倒掉，避免瓶口残留导致易污染），用不含钙镁离子的PBS清洗（与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次；目的是洗去残留的血清，避免影响胰酶的活性。），加入适量消化液（以 T-25 的培养瓶为例，向瓶内加入1ml胰蛋白酶（请根据各细胞的指引使用合适的浓度）），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃，反应3~5分钟。
5. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
6. 弃去胰蛋白酶液，加入2-3ml新鲜的含血清的完全培养液终止消化反应，小心吹打成细胞悬液。
7. 将细胞悬液吸入10 ml离心管中。平衡后将离心管放入离心机中，以1000 rpm/min离心5 min。
8. 弃去上清液，加入适当体积的培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
9. 将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
10. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×10⁵/ml。最后要做好标记。
11. 继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO₂培养箱中继续培养。传代细胞2-4 h后开始贴附在瓶壁上。

注意事项：
1.严格的无菌操作
2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

细胞冻存

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具体操作：

一、冻存前准备

1. 准备适量冻存管，做好标记后置于4℃冰箱预冷；

2. 配制冻存液，一般为用培养液配制10% DMSO；

3. 梯度冻存盒。

二、细胞冻存：

1. 按照细胞传代步骤1-7操作制备细胞悬液并离心；

2. 弃去上清，加入适当体积的冻存液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液；

3. 将1 ml细胞悬液（细胞的终密度为5~10×10⁵个/ml）加入之前已做好标记的冻存管中并做好记录；

4. 将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜（如果没有冻存盒，可以先在4℃冰箱放置30 min，然后转移至-20℃放置1-2 h，最后转移至-80℃过夜），第二天取出放入液氮罐，并记录好位置信息。

DMSO的作用是取代细胞中的一些水，以防止冰晶形成，刺穿细胞。据赛默飞世尔科技的资深科学家Rhonda Newman介绍，DMSO还能防止细胞在冷冻期间发生收缩，而后在解冻时又变得肿胀。

细胞冻存液一般有两种配置方法：
1.培养基：血清：DMSO=7：2：1
2.血清：DMSO=9：1
普通细胞系可以用第一种配方冻存，比较娇贵的细胞系用第二种配方冻存。

注意事项：
1. 使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。
2. 不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。
3. 注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。

参考：https://mp.weixin.qq.com/s?src=11&timestamp=1584940192&ver=2233&signature=ovYEowV0YDLbWtmGxgAVtINHDQNSyO4hLdgtwF1HJ5F9LsQBanLmLIGk3rI19BJI0eLogKOpdCMWXYe0UujxKqfS2wulm2Mt2qrGhkt2KxWNj1JhHldq9mwZIMozHx&new=1