WGCNA（Weighted Correlation Network analysis）是一个基于基因表达数据，构建基因共表达网络的方法。WGCNA和差异基因分析（DEG）的差异在于DEG主要分析样本和样本之间的差异，而WGCNA主要分析的是基因和基因之间的关系。WGCNA通过分析基因之间的关联关系，将基因区分为多个模块。而最后通过这些模块和样本表型之间的关联性分析，寻找特定表型的分子特征。
网上例子千千万，但是大部分都是从文档翻译而来，要用起来还是有些费劲，要深入的可以移步这里：http://www.stat.wisc.edu/~yandell/statgen/ucla/WGCNA/wgcna.html
下面我将根据TCGA乳腺癌基因表达数据以及乳腺癌压型数据，一步一步的使用WGCNA来进行乳腺癌各个亚型共表达模块的挖掘。
数据准备
首先我们需要下载TCGA 的乳腺癌的RNA-seq数据以及临床病理资料，我这里使用我们自己开发的TCGA简易下载工具进行下载
首先下载RNA-Seq：
下载之后共得到1215个样本表达数据
进一步下载临床病理资料
进一步点击 ClinicalFull按钮对病理资料进行提取得到ClinicalFull_matrix.txt文件，使用Excel打开ClinicalFull_matrix.txt文件可以看到共有301列信息，包含了各种用药，随访，预后等等信息，我们这里选择乳腺癌ER、PR、HER2的信息，去除其他用不上的信息，然后选择了其中有明确ER、PR、HER2阳性阴性的样本，随机拿100个做例子吧。
样本筛选完了，现在轮到怎么获取这些样本的RNA-seq数据啦，前面下载了一千多个样本的RNA-seq,从里面找到这一百个样本的表达数据其实也是不需要变成的啦，看清楚咯
首先打开RNA-Seq数据目录的fileID.tmp(用Excel打开)，然后可以看到两列：
将第二列复制，并且替换-01.gz为空
使用Excel的vlookup命令将临床病理资料的那100个样本进行映射
然后筛选非N/A的就得到了这一百个样本对于的RNA-seq数据信息
进一步删除其他的样本，还原成fileID.tmp格式保存退出：
然后使用TCGA简易小工具“合并文件”按钮就得到表达矩阵了，进一步使用ENSD_ID转换按钮就得到了基因表达矩阵和lncRNA表达矩阵了
R代码实现WGCNA
setwd('E:/rawData/TCGA_DATA/TCGA-BRCA')
samples=read.csv('ClinicalFull_matrix.txt',sep = '\t',row.names = 1)
dim(samples)
#[1] 100 3
expro=read.csv('Merge_matrix.txt.cv.txt',sep = '\t',row.names = 1)
dim(expro)
#[1] 24991 100
数据读取完成，从上述结果可以看出100个样本，有24991个基因，这么多基因全部用来做WGCNA很显然没有必要，我们只要选择一些具有代表性的基因就够了，这里我们采取的方式是选择在100个样本中方差较大的那些基因（意味着在不同样本中变化较大）
继续命令：
m.vars=apply(expro,1,var)
expro.upper=expro[which(m.vars>quantile(m.vars, probs = seq(0, 1, 0.25))[4]),]##选择方差最大的前25%个基因作为后续WGCNA的输入数据集
通过上述步骤拿到了6248个基因的表达谱作为WGCNA的输入数据集，进一步的我们需要看看样本之间的差异情况
datExpr=as.data.frame(t(expro.upper));
gsg = goodSamplesGenes(datExpr, verbose = 3);
gsg$allOK
sampleTree = hclust(dist(datExpr), method = "average")
plot(sampleTree, main = "Sample clustering to detect outliers"
, sub="", xlab="")
从图中可看出大部分样本表现比较相近，而有两个离群样本，对后续的分析可能造成影响，我们需要将其去掉，共得到98个样本
clust = cutreeStatic(sampleTree, cutHeight = 80000, minSize = 10)
table(clust)
#clust
#0 1
#2 98
keepSamples = (clust==1)
datExpr = datExpr[keepSamples, ]
nGenes = ncol(datExpr)
nSamples = nrow(datExpr)
save(datExpr, file = "FPKM-01-dataInput.RData")
得到最终的数据矩阵之后，我们需要确定软阈值，从代码中可以看出pickSoftThreshold很简单，就两个参数，其他默认即可
powers = c(c(1:10), seq(from = 12, to=20, by=2))
sft = pickSoftThreshold(datExpr, powerVector = powers, verbose = 5)
##画图##
par(mfrow = c(1,2));
cex1 = 0.9;
plot(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
xlab="Soft Threshold (power)",ylab="Scale Free Topology Model Fit,signed R^2",type="n",
main = paste("Scale independence"));
text(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
labels=powers,cex=cex1,col="red");
abline(h=0.90,col="red")
plot(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5],
xlab="Soft Threshold (power)",ylab="Mean Connectivity", type="n",
main = paste("Mean connectivity"))
text(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5], labels=powers, cex=cex1,col="red")
从图中可以看出这个软阈值选择7比较合适,选择软阈值7进行共表达模块挖掘
pow=7
net = blockwiseModules(datExpr, power = pow, maxBlockSize = 7000,
TOMType = "unsigned", minModuleSize = 30,
reassignThreshold = 0, mergeCutHeight = 0.25,
numericLabels = TRUE, pamRespectsDendro = FALSE,
saveTOMs = TRUE,
saveTOMFileBase = "FPKM-TOM",
verbose = 3)
table(net$colors)
# open a graphics window
#sizeGrWindow(12, 9)
# Convert labels to colors for plotting
mergedColors = labels2colors(net$colors)
# Plot the dendrogram and the module colors underneath
plotDendroAndColors(net$dendrograms[[1]], mergedColors[net$blockGenes[[1]]],
groupLabels = c("Module colors",
"GS.weight"),
dendroLabels = FALSE, hang = 0.03,
addGuide = TRUE, guideHang = 0.05)
从图中可以看出大部分基因在灰色区域，灰色部分一般认为是没有模块接受的，从这里也可以看出其实咱们选择的这些基因并不是特别好那么做到这一步了基本上共表达模块做完了，每个颜色代表一个共表达模块，统计看看各个模块下的基因个数：
那么得到模块之后下一步该做啥呢，或许很多人到这就不知道如何继续分析了
这里就需要咱们利用这些模块搞事情了，举个例子
如果你是整合的数据（整合lnc与gene），那么同时在某个模块中的基因和lncRNA咱们可以认为是 共表达的，这便是lnc-gene共表达关系的获得途径之一了，进一步你可以根据该模块的基因-lnc-基因之间的关系绘制出共表达网络
今天咱们这里不讲这个，而是跟表型关联，咱们已经拿到了这98个样本的ER、PR、HER2阳性阴性信息，那么进一步的咱们可以看看哪些共表达模块跟ER、PR、HER2阴性最相关，代码如下：
moduleLabelsAutomatic = net$colors
moduleColorsAutomatic = labels2colors(moduleLabelsAutomatic)
moduleColorsFemale = moduleColorsAutomatic
MEs0 = moduleEigengenes(datExpr, moduleColorsFemale)$eigengenes
MEsFemale = orderMEs(MEs0)
samples=samples[match(row.names(datExpr),paste0(gsub('-','.',row.names(samples)),'.01')),]#匹配98个样本数据
trainDt=as.matrix(cbind(ifelse(samples[,1]=='Positive',0,1),#将阴性的样本标记为1
ifelse(samples[,2]=='Positive',0,1),#将阴性的样本标记为1
ifelse(samples[,3]=='Positive',0,1),#将阴性的样本标记为1
ifelse(samples[,1]=='Negative'&samples[,2]=='Negative'&samples[,3]=='Negative',1,0))#将三阴性的样本标记为1
)#得到一个表型的0-1矩阵
modTraitCor = cor(MEsFemale, trainDt, use = "p")
colnames(MEsFemale)
modTraitP = corPvalueStudent(modTraitCor, nSamples)
textMatrix = paste(signif(modTraitCor, 2), "\n(", signif(modTraitP, 1), ")", sep = "")
dim(textMatrix) = dim(modTraitCor)
labeledHeatmap(Matrix = modTraitCor, xLabels = colnames(trainDt), yLabels = names(MEsFemale),
ySymbols = colnames(modlues), colorLabels = FALSE, colors = greenWhiteRed(50),
textMatrix = textMatrix, setStdMargins = FALSE, cex.text = 0.5, zlim = c(-1,1)
, main = paste("Module-trait relationships"))
最终找到几个共表达网络与三阴性表型最相关的模块。
到了这一步其实还没完，咱们已经拿到了最相关的模块比如上图中的yellow模块，那么yellow模块中的基因，哪些基因最重要，我们该如何获取
首先我们需要计算每个基因与模块的相关关系
modTraitCor = cor(MEsFemale, datExpr, use = "p")
modTraitP = corPvalueStudent(modTraitCor, nSamples)
corYellow=modTraitCor[which(row.names(modTraitCor)=='MEyellow'),]
head(corYellow[order(-corYellow)])
#RAD51AP1 HDAC2 FOXM1 NCAPD2 TPI1 NOP2
#0.9249354 0.9080872 0.8991733 0.8872607 0.8717050 0.8708449
从上诉结果中可以看出RAD51AP1,HDAC2两个基因与yellow相关性最好，也就是说这两个基因是yellow模块的hub-gene
进一步的咱们导出yellow模块的基因共表达关系使用cytoscape进行可视化，代码如下：
TOM = TOMsimilarityFromExpr(datExpr, power = pow);
probes = names(datExpr)
mc='yellow'
mcInds=which(match(moduleColorsAutomatic, gsub('^ME','',mc))==1)
modProbes=probes[mcInds]
modTOM = TOM[mcInds, mcInds];
dimnames(modTOM) = list(modProbes, modProbes)
cyt = exportNetworkToCytoscape(modTOM,
edgeFile = paste("edges-", mc, ".txt", sep=""),
nodeFile = paste("nodes-", mc, ".txt", sep=""),
weighted = TRUE,
threshold = median(modTOM),
nodeNames = modProbes,
#altNodeNames = modGenes,
nodeAttr = moduleColorsAutomatic[mcInds]);
到此基本结束了，敲这么多字。。。。。。好累。。。。。
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