为探究肺成纤维细胞在协调组织病毒感染部位的免疫反应中的作用，美国圣犹大儿童研究医院和中国广州医科大学第一附属医院的研究人员利用单细胞转录组测序及空间转录组测序技术，对呼吸道感染的模型小鼠肺进行研究，揭示了成纤维细胞在平衡炎症和肺功能方面的关键作用，相关成果于2020年11月发表于Nature杂志（IF：49.962）。
接下来小编带大家一起走进这篇文章
过度的成纤维细胞激活通过ADAMTS4损害肺部功能
Exuberant fibroblastactivity compromises lung function via ADAMTS4
发表杂志：Nature（IF：49.962）；
发表时间：2020年11月；
应用技术：10xGenomics单细胞转录组测序；10x Genomics空间转录组测序；
研究背景
呼吸道感染是发病和死亡的主要原因，这些感染可导致急性呼吸窘迫综合征（ARDS），并伴有肺水肿和缺氧，导致轻微至严重的呼吸衰竭。大部分由病毒感染引起的肺损伤是免疫细胞浸润的结果，免疫细胞杀死了感染的和周围的细胞。改变病原体清除和免疫病理学之间的平衡机制有助于确定改善ARDS预后。治疗靶点包括肺细胞外基质（ECM）的组成部分， 肺损伤时，ECM蛋白酶上调并重塑ECM，促进免疫细胞向炎症部位迁移。虽然有大量的研究关于免疫细胞如何调节宿主对呼吸道病毒感染的反应，但关于非造血细胞的异质性和作用的研究较少。
主要结果
1. 流感感染后肺基质细胞反应
对感染甲型流感病毒0、1、3和6天后小鼠CD45-肺细胞进行分类，并进行了单细胞转录组测序，确定了三个主要细胞群：成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞（图1a, b），成纤维细胞尤其活跃，感染后出现多种转录状态（图1c, d）。根据基因表达确定了三个主要的功能组：静息、ECM合成和炎症（图1c）。ECM合成成纤维细胞（ESFibs）在编码ECM结构蛋白的基因中富集，但缺乏炎症信号（图1d）。炎症成纤维细胞表现出参与I型干扰素、白细胞介素-6（IL-6） 或NF-κB信号通路的高表达，而静息成纤维细胞缺乏参与炎症反应或ECM蛋白合成通路的强富集（图1e）。在炎症成纤维细胞中，确定了两种不同的激活状态，损伤反应性成纤维细胞（DRFibs）和干扰素反应性成纤维细胞（IRFibs）（图1d）。DRFibs在参与组织损伤反应的通路中富集，而IRFibs在I型干扰素响应通路中富集（图1e）。为验证这些成纤维细胞激活状态，作者鉴定了小鼠和人肺中DRFibs和IRFibs中编码表面蛋白标记物的基因。Itga5 的上调和Cd9 的下调定义了DRFibs转录程序，而Bst2 的上调和Cd9 的表达定义了IRFibs。在小鼠中，DRFibs的频率和数量在感染过程中增加，在12天左右达到峰值；DRFibs在第3天迅速出现，频率逐渐降低。通过人肺单细胞结果对比发现成纤维细胞激活状态类似于小鼠。
图 1 病毒感染期间细胞的单细胞基因表达谱分析
2. 成纤维细胞活化的调控
为确定调节成纤维细胞激活状态的上游刺激因素，本研究检测了体外正常人支气管上皮细胞（NHBEs）与人季节性病毒（H3N2）或禽类病毒（H5N6或H7N9）的感染是否足以驱动共培养的人肺成纤维细胞的炎症转录程序（图2a）。NHBEs感染诱导成纤维细胞表达炎性状态丰富的基因。另外，本研究测试了单个细胞因子和流感病毒在自身培养的呼吸道细胞中刺激这些转录程序的能力（图2a），并将其与流感病毒感染患者的鼻腔冲洗细胞（主要包括免疫细胞）进行比较，结果显示了ECM相关基因的细胞类型特异性表达。与NHBEs相比，成纤维细胞对IL-1细胞因子和TNF的刺激高度敏感，ECM相关基因广泛上调（图2a）。
3. 活化成纤维细胞中的ECM蛋白酶
本研究分析了流感病毒感染期间不同时间收集的小鼠肺匀浆中ECM相关基因的表达调控，结果显示ADAMTS4（一种降解蛋白多糖versican的酶）最早被诱导表达，且在整个修复阶段持续。根据scGEX分析，Adamts4 的表达仅限于非免疫基质细胞。接下来我们对感染前后的免疫和非免疫人群进行分类。感染前，Adamts4 基因的表达仅限于成纤维细胞和内皮细胞。感染后，仅在成纤维细胞中观察到Adamts4 表达的显著上调，这解释了感染肺中Adamts4 高表达的原因（图2d）。
为确定成纤维细胞反应在解剖学上是如何组织的，采集10 dpi的小鼠肺组织切片进行空间转录组学研究。结果表明成纤维细胞相关基因在肺切片中的相对表达变化，Adamts4 的表达局限于肺泡附近的间质炎症区。DRFib相关基因在支气管区域（绿色，2）、密集淋巴浸润区域（青色，3）和正常肺泡实质区域（黄色，1）的表达减少或缺失（图2e）。总之，当宿主开始恢复或病情恶化时，DRFibs的Adamts4 基因表达在远端气道中是一个关键的拐点。
图2 ADAMTS4是由流感病毒感染诱导的肺成纤维细胞源性ECM蛋白酶
4. ADAMTS4促进致死免疫病理
为了确定ADAMTS4对感染结果的影响，本研究用致死剂量的甲型流感病毒感染Adamts4 -/-和Adamts4 +/+小鼠。与Adamts4+/+对照组相比，Adamts4 -/-小鼠表现出了更高的存活率（图3a, b），并且Adamts4 -/-小鼠在6dpi时能够维持肺功能（图3c）。当dpi为9dpi时，Adamts4 -/-小鼠的免疫细胞浸润和肺泡炎症显著减少，肺组织损伤较小（图3d）。这些组织损伤的差异转化为Adamts4 -/-小鼠肺力学的改善。
本研究探究了ADAMTS4缺乏对versican （ADAMTS4的主要作用底物）水平的影响。与Adamts4+/+小鼠相比，Adamts4 -/-小鼠在感染后肺重塑区域表现出更高水平的完整versican。由于CD8+ T细胞是甲型流感病毒感染期间免疫病理的主要驱动因素之一，本研究在9 dpi（T细胞应答峰值和肺损伤的时间点） 评估了肺中的CD8+ T细胞应答。Adamts4 -/-小鼠产生IFN γ的CD8+ T细胞百分比显著降低（图3f）。甲型流感病毒特异性CD8+ T细胞百分比在Adamts4 +/+和Adamts4 -/-小鼠之间没有差异。这表明Adamts4 -/-小鼠能够获得与野生型小鼠类似的甲型流感病毒特异性T细胞应答（图3g）。与Adamts4 +/+小鼠相比，Adamts4 -/-小鼠肺切片中的T细胞明显减少，T细胞在高度完整的versican区域基本缺失（图3h）。接下来，本研究测试了成纤维细胞来源的ADAMTS4是否能促进T细胞穿越versican屏障（图3i）。
在ADAMTS4充足的成纤维细胞存在时，活化的CD8+ T细胞穿过未包被和versican包被的膜的效率无差异。相比之下，在ADAMTS4缺失的Adamts4-/-中，活化的CD8+ T细胞通过versican包被的膜的效率降低了40%以上。与DRFibs是ADAMT4的主要产生者一致，DRFibs促进了穿过versican屏障的迁移，而在静息的成纤维细胞和IRFibs存在下，迁移受到抑制（图3j），突出了不同成纤维细胞激活状态的不同功能。
图3 在甲型流感病毒感染小鼠期间，ADAMTS4促进致死性免疫病理
研究结论
本文利用单细胞转录组及空间转录组测序技术针对呼吸道感染的模型小鼠和人肺组织进行研究，鉴定了肺损伤过程中的成纤维细胞的转录组表达图谱，发现呼吸道病毒感染会导致肺部纤维化，增加细胞因子和酶ADAMTS4的产生，而ADAMTS4会降解结构性肺蛋白versican，进而导致肺功能损伤。这揭示了成纤维细胞在平衡炎症和肺功能方面的关键作用，并为相关新药物的研发提供依据。
参考文献
BoydDF, Allen EK, Randolph AG, et al. Exuberant fibroblast activity compromiseslung function via ADAMTS4. Nature. 2020; 587(7834): 466-471.
李超 | 文案
网友评论