测序深度(Sequencing Depth)
- 相当于测了几遍；
- 指测序得到的总碱基数（bp）与所测物种基因组大小的比值，其是评价测序量的重要指标之一；
- 如：测序产生了1000条读段（read），每条读段的长度为50bp，所测物种的基因组大小为10000bp，那么测序深度为1000*50/10000=5X。
- 一般来说，测序深度越深越好，当然还需考虑一个成本的问题。
- 全基因组测序，一般测序深度为30X以上对检测基因组变异的可靠性会有很大帮助。
- 测序产生的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。
此外还有测序覆盖度（Sequencing Coverage）：是指测序数据匹配到参考基因组上后，能够覆盖基因组的区域比率。因为基因组有些区域重复序列较复杂或测序难以捕获到，那么这些区域可能就不会被测序读段所覆盖。
如测序产生了1000条读段（read），每条读段的长度为50bp，所测物种的基因组大小为10000bp，测序读段匹配到参考基因组后能够覆盖9000bp的参考基因组，那么测序覆盖度就为9000/10000=90%。
RPKM、FKPM、TPM、CPM
- 统计比对到基因上的reads即为的counts即为测序原始表达矩阵，rawdata。
- 但由于两大原因（不同样本的测序深度，不同基因的长度）直接用counts比较将没有意义，因此需要进行标准化。
（1）不同样本的测序深度：例如sample1测序深度为5X，sample2测序深度为15，自然sample2的基因counts都比sample1的高很多。如若消除，计算比例即可。即针对每一样本，计算每一个基因counts相对于整体测序深度的比例。
（2）不同基因的长度：例如geneA长度为1KB，geneB长度为10KB；那么geneB的counts数总体都大于geneA。若相除，则计算基因平均每KB的表达量即可。
- RPKM、FKPM、TPM是实现消除上述二者影响的方法，三者差异如下。
RPKM
- Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads
- 公式大致就是某一基因的counts先除以测序深度（总reads数），再除以基因长度。
（1）由于总reads太大了，直接除以这个数字就会使得标准化出来的Read数出现太多的小数，所以为了美观，一般都是除以以百万为单位的总Read数；假定一次RNA-seq的总Read数为2*10^7， 那么在进行Read标准化的时候，并不是直接除以这个数值，而是除以20，因为2*10^7 = 20*10^6 = 20M
（2）第二次除以的基因长度值，按KB为单位，即1000。
注意顺序：是先除以总reads数；再除以基因长度。
RPKM1--原始counts
RPKM2--深度标准化（单位为10）
RPKM3--基因长度标准化（KB）
参考笔记“手动”计算FPKM，可以更好的理解这个公式。
FPKM
- FPKM同RPKM是一样的，只是RPKM用于单末端测序，而FPKM用于双末端测序。
TPM
- TPM的计算方法其实也同RPKM很类似，同样的对基因长度和测序深度进行标准化；
-
即counts先除基因长度，再除总reads数。这样每个样本最后的结果和都相等，不同样本间差异更清楚。
TPM1--原始counts'
TPM2--基因长度标准化（KB）
TPM3--深度标准化（单位为10）
可以看到每个样本的TPM的总和是相同的（都是10），这就意味着TPM数值能体现出比对上某个基因的reads的比例，使得该数值可以直接进行样本间的比较。
事实也证明TPM的标准化方法更有优势，目前都已经推荐进行TPM标准化，不再使用了RPKM、FPKM了。
CPM
- Counts per million (CPM) mapped reads are counts scaled by the number of fragments you sequenced (N) times one million. This unit is related to the FPKM without length normalization and a factor of 10^3
- 即只对测序文库（每个样本总reads数）标准化，而不对长度标准化。这是因为，差异分析往往是同一基因在两组或多组样本量的差异，因此不必在计算单位长度基因的表达量。
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