【张勇】ChIP-seq 讲习班

参考：

本讲 PPT 下载链接为：http://pan.baidu.com/s/1skJAaAx，密码：ga2l
视频链接：https://mp.weixin.qq.com/s/JLPQbgQKUpa4ONNhzURQxw

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第一部分：ChIP-seq 简介

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• 首先了解两个概念：

Cistrome: the set of cis-acting targets of a transacting factor on a genome scale.

Epigenome: a parallel to the word "genome"; the overall epigenetic state of a cell

• 一般的双端测序，R1/R2 比对到两条链上面。通过Flag 可以提取比对到正反链的read,使用基因组浏览器可视化得到两个峰图。

  （Tips:而ChIA-PET 也是双端测序，但是R1/R2 可能同一条链)

  参考： 双端测序中read1和read2的关系

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• 张勇老师开发出第一个peak callling 工具（macs,现在更新到macs3，由师弟刘涛维护！）

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• ChIP-exo ： 从5 -end 进行酶切，提高TFBS分辨率,几乎直接看peak,而不需要软件找。

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• iChIP : 对不同细胞进行index,再进行抗体富集，运用到单细胞领域.

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• 不同的TF 结合模型：

  一般TF是sharp peak.

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第二部分：ChIP-seq 实验设计

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• 关于实验重复及其测序深度：

  • 以人类为例，一般对于转录因子达到20M，宽峰达到40M read 比较好。当然read越多越好，但是read 不太多，足以检测结合比较强的位点。
  • 重复的问题，由于刚开始的一些文章ChIP-seq没有重复，带了一个不好的头，后面慢慢要求2-3个重复（2-3个质量好的重复，不是做了3个重复就好）。
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• 对照组：一般来说Input 和IgG 有一个就行，对于一些特别容易富集的区域，也就是假阳性，可以通过对照组来过滤掉。

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第三部分：检测ChIP质量

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• 通过IGV浏览器查看peak 是否明显

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• 通过计算Frip 值：不同的TF，Frip 大小不同，结合越强的位点，Frip 可能越高

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• 交联系数：通过移动 计算正反链read 皮尔逊相关系数变化过程。

  • 高质量的ChIP 正负链的peak ，移动到最大 重叠位置，相关系数最大，也就是图中ChIP peak 位置。
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• 同时比较两个peak高度值，计算差异倍数，得到NSC/RSC 结果.下图左边为质量高的实验结果.

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• 同时计算Frip 和NSC关系，两者之间存在明显的联系.也就是说Frip 高的NSC,RSC 往往也较高。

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• IDR 方法：此方法对于重复间质量好的样本，IDR可能效果好，否则满足条件的peak 会很少。

  从B图可知，20000左右的peak ,IDR （不可重复率）较低，也就是peak 很可信。

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• 也可以通过peak 区域motif 富集情况，评价质量好坏。

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• 通过序列保守型来看：也就是通过通过profile 图反映出富集效果。

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第四部分：完成项目后，需要提交哪些数据

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第五部分：分析流程

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• 第一步：数据比对

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• 下一步：peak calling

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• 要发布的部分peak calling 工具

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• 下一步：差异peak 分析

  • 定性问题：通过设置阈值，对两组sample进行peak 差异位点分析。得到有无peak的差异结果，但是对于一些在阈值边界的位置，可能得到的差异peak 位点，存在假阳性问题。
  • 定量问题：通过差异倍数，及其显著性来判断差异peak. 对于组蛋白修饰来说，修饰水平的高度和表达强弱有关系；但是对于转录因子来说，可能没有太大影响。
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• 差异peak 目前的工具

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• 下一步：peak注释

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• 下一步：motif 分析

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• 目前的工具

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• 下一步：靶基因预测

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• 也可以尝试对TF进行敲除，过表达研究目标基因.

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• 下一步：目标基因GO注释

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思考

• 感觉做差异分析时候，定量分析采取Deseq2 或者DiffBind 结果差别较大时候，不好判断选择哪一个工具result.

• 了解到ChIP-seq 靶基因寻找工具。比如结合RNA-seq结果，判断敲除TF,那些基因是差异基因。工具如BETA

  
  

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